單細胞免疫組庫測序在免疫治療應答機制研究中的應用

免疫檢查點阻斷治療法目前已應用于多種乳腺癌亞型的治療，但是患者的免疫應答具有異質性。這種決定治療效果異質性的機制和標志物的鑒定是該領域的研究重點。本研究中，研究者通過單細胞轉錄組+TCR測序技術對接受抗PD1治療的乳腺癌患者治療前、中樣品進行分析，探究治療前后腫瘤內細胞表達特征的變化。

文章詳情

文章題目：A single-cell map of intratumoral changes during anti-PD1 treatment of patients with breast cancer.

中文題目：乳腺癌患者抗PD1治療期間腫瘤內變化的單細胞圖譜

發(fā)表時間：2021.5

期刊名稱：Nature Medicine

影響因子：36.131

實驗平臺：10x Genomics Chromium（5‘表達文庫+TCR VDJ富集文庫）、CITE-seq

樣本類型和數(shù)量：

激素受體陽性或三陰性乳腺癌患者的治療前和治療中配對的活檢樣品，接受抗PD1治療患者（n=29）和新輔助化療后接受抗PD1治療患者（n=11）

DOI：10.1038/s41591-021-01323-8


研究背景

三陰性乳腺癌（TNBC）在乳腺癌（BC）患者占約15%，且其中具有大量腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs），說明免疫檢查點阻斷（ICB）可能是針對TNBC的較好的治療方式。而新輔助化療期間加入抗PD１治療早期TNBC可增加病理完全緩解率和無事件生存率。此外，新輔助ICB療法還可用于BC其他亞型（ER^＋和HER２^-）。然而，并不是所有BC患者都能對新輔助ICB療法應答，因此探究其中的原因和鑒定能決定治療效果的相關標志物就成為亟待解決的問題。很多研究表明，T細胞的克隆性擴增是ICB治療反應的基礎，使用單細胞測序技術可獲得T細胞擴增的模式和機制。然而，目前的研究都只著眼于容易獲得的樣品、較少的患者數(shù)或只專注于CD45⁺免疫細胞。因此，研究者使用單細胞轉錄組測序，單細胞TCR測序和CITE-seq方法對40例患者組織進行測序，以達到鑒定BC患者ICB治療應答機制的目的。


研究內容

// 抗PD1治療前和治療中的單細胞圖譜分析

研究者所用的兩個研究隊列：１.未經治療的非轉移性原發(fā)性乳腺浸潤癌患者在手術前大約９±２天接受pembrolizumab（Keytruda或抗PD1）治療；2.接受了為期20-24周的新輔助化療，隨后在手術前接受了pembrolizumab治療。在兩個隊列中，“治療前”樣品指在抗PD1治療前立即收集的活檢組織，“治療中”樣品指在手術中收集的，包含了不同的BC亞型患者。

針對隊列1的配對樣品使用單細胞免疫組庫測序（轉錄組+TCR），獲得了惡性乳腺上皮細胞、免疫細胞、內皮細胞和成纖維細胞。其中，惡性乳腺上皮細胞拷貝數(shù)不穩(wěn)定，且在患者中的分布具有特異性，治療前、中的組織或不同BC亞型之間沒有聚類偏倚。TCR結果分析發(fā)現(xiàn)9名患者的配對樣品均發(fā)生克隆性擴增，研究者命名其為“E（s）”，其他20名命名為“NE（s）”。治療過程中一些克隆型消失了，說明T細胞發(fā)生了克隆型收縮，不過克隆型收縮沒有克隆型擴增明顯，且在Es和NEs中平均分布。值得注意的是，有些NE（n=11）治療前T細胞比例較高，但在抗PD1治療后不能擴增。其余的NEs 的T細胞頻率較低而且也不能擴增。此外，治療中樣品里61%的擴增T細胞的克隆型在治療前就已存在。
 

Fig 1. 實驗設計、細胞注釋和T細胞表現(xiàn)型

 

// 表達PD1的T細胞在抗PD1治療后增殖

接下來，研究者根據(jù)不同分組比較單細胞轉錄組結果。治療前，成纖維細胞多見于NEs中，T細胞則多見于Es中。治療中，癌細胞和成纖維細胞在NEs中更多見，T細胞在Es中進一步富集。對T細胞做亞亞群分析鑒定到表達PD1的CD8⁺和 CD4⁺細胞群（具有耗竭樣特征的活化T細胞），并命名為TEX cells。研究者還鑒定到一個高度增殖的T細胞組成的PD1⁺細胞群，在治療前、中相對豐度高，且在治療過程中增加。在治療中，擴增T細胞主要由CD4⁺和CD8⁺TEX 細胞組成，但也有一部分CD8⁺效應/記憶細胞。Es與NEs相比，治療前、中樣品的T細胞克隆性和Gini指數(shù)增加，TEX cells克隆性最強，而克隆型豐度則恰好相反。此外，通過CITE-seq證實Es治療前T細胞的PD1蛋白表達增加。總之，PD1⁺T cells的比例與T細胞擴增相關，CD8⁺和CD4⁺TEX 細胞是抗PD1治療后主要的擴增T細胞。

// 沿CD８^＋TEX或CD4^＋TH1、TFH細胞軌跡的T細胞擴增治療后增殖

研究者構建了CD8⁺T細胞的偽時間軌跡。T_N細胞是軌跡的起點，連接T_EM細胞，隨后出現(xiàn)三條分支：T_EX1和T_EX2、T_RM、T_EMRA。Es與NEs相比，無論是治療前和治療中，TEX細胞更多見于軌跡的末端。Es治療中的T_EX細胞具有更多的“顯著效應活性”和“短暫/早期耗竭”特征。此外，在所有軌跡中，Es比NEs具有更少的TCR豐度，與治療前相比，治療中的TCR豐度減少更明顯，說明抗PD1誘導T細胞擴增。擴增的TEX細胞在軌跡末尾處富集，尤其是治療過程中。

在CD4⁺T細胞軌跡中，T_EX細胞分裂成T_H1和T_FH細胞。軌跡從T_N1出發(fā)，向T_N2移動，隨后是T_EM1-3，然后分裂成T_H1或T_FH細胞。NEs中的這2類細胞治療前和治療中都保持早期的前效/記憶狀態(tài)，而Es治療中，T細胞活性和早期耗竭標志物表達增加。TCR豐度在接近軌跡末端時下降，尤其是在Es的T_H1細胞里。而在Es治療中，增殖在接近末端時增加。當沿著軌跡比較擴增和非擴增的CD4⁺T細胞時，T_H1和T_FH細胞在軌跡末期富集，尤其是Es治療中�？傮w而言，T_H1和T_FH細胞對克隆型擴增有重要貢獻，表明它們支持CD8⁺ TEX細胞正在進行的效應功能。另外，沿著CD8⁺TEX細胞或CD4⁺T_H1細胞軌跡分析基因表達模式，發(fā)現(xiàn)了Es和NEs中表達或激活的差異基因和信號通路。

Fig 2. CD8⁺和CD4⁺T細胞軌跡分析

//  T細胞表達特征預測T細胞擴增

將治療前擴增和非擴增T細胞比較篩選差異基因并結合GSEA分析發(fā)現(xiàn)，非擴增T細胞更加naive，而擴增T細胞則具有效應功能、免疫細胞歸巢、細胞毒性、抗原提呈特性，同時也主要表達免疫檢查和腫瘤反應性T細胞marker基因。克隆型擴增的數(shù)量也與這些基因及其相關通路有關。治療前Es與NEs相比，免疫檢查標志物和CD4⁺T_H1活性預測T細胞擴增效果最好。CITE-seq結果證實NEs中的naive T細胞標志物表達更高，而免疫檢查點、腫瘤反應性和共刺激標志物表達更低。將TNBC Es（n=5）與ER+BC（n=3）比較發(fā)現(xiàn)擴增的克隆型數(shù)量沒有差異，但TNBC中，治療前T細胞的PD1表達和增殖T細胞數(shù)量更高。與ER+Es比較，TNBC中擴增性CD8⁺T細胞效應功能上調，而其中的CD4⁺T細胞上調表達抗原提呈基因。相反地，ER+Es的擴增性CD8⁺、CD4⁺T細胞過表達naive和前效相關標志物，說明與TNBC相比雖然T細胞擴增程度相似，但分化程度較低。
 

Fig 3. BC和BC亞型中的擴增性與非擴增性T細胞比較

// 新輔助化療和抗PD1治療后的T細胞擴增

研究者使用相同研究策略分析隊列２的治療前和治療中樣品，得到了3名Es。在Es中，T細胞和pDCs增多，在治療前、中樣品，PD1表達和CD4⁺及CD8⁺TEX細胞均增多。比較治療前擴增和非擴增T細胞，發(fā)現(xiàn)了與只接受抗PD1的患者相似的差異基因或信號通路。T_H1活性和其中的50個特征差異基因可有效預測T細胞擴增，證明當新輔助化療與抗PD1結合時，CD4⁺T_H1細胞也參與T細胞擴增。

// 樹突狀細胞（DC）和巨噬細胞與T細胞擴增的關系

將隊列1患者得到的DC再分群獲得了6個DC亞群。與NEs相比，Es的PD-L1和PD-L2表達量增加，在DC中，PD-L1只在mregDC亞群表達。Es治療前的mregDC相對頻率較高，而其他類型DC的相對頻率在Es與NEs的治療前樣品中并無太大差異。pDC、ASDC和mregDC在Es治療中數(shù)量更多。此外，研究者還篩選了Es與NEs治療前、中的差異基因涉及的功能及通路�？傊�，DC在ES中，無論治療前還是治療中，都具有免疫應答功能且支持T細胞功能。

與DC類似，巨噬細胞表達PD-L1和PD-L2，在治療前，這兩個基因、幾個細胞因子（CXCL9等）和I/II型干擾素應答基因在ES中的上調表達，而CX3CR1和C3下調表達。
 

Fig 4. 表達PD-L1的樹突細胞與巨噬細胞與T細胞擴增的關系

// T細胞擴增的腫瘤中，癌細胞受抗PD1治療影響

在Es中，癌細胞數(shù)量隨治療變少。盡管在癌細胞中未能檢測到PD-L1的表達，但大量抗原提呈MHC I/II型基因在NEs中下調表達，與NEs相比，抗原加工及提呈和IFN-γ 應答信號通路在Es中上調表達。將Es治療前、中相比較發(fā)現(xiàn)，治療中的癌細胞具有一種持續(xù)的抗腫瘤反應，且富集細胞增殖、蛋白水解、細胞死亡、免疫信號和細胞毒性通路。最后，研究者分析了各類細胞的相對頻率與T細胞擴增的相關性，并使用CellphoneDB分析配體受體互作關系，確認了不同樣品細胞內的共刺激與共抑制作用。

主要結論

本研究對象為在手術前進行抗PD1治療的激素受體陽性或三重陰性（TNBC）的乳腺癌（BC）患者，針對只接受抗PD１治療的患者（29例）或先接受新輔助化療后再接受抗PD1治療的患者（11例）的活檢組織（治療前和治療中的配對組織），進行單細胞轉錄組、TCR和蛋白組分析。主要結論如下：

1. 三分之一腫瘤包含表達PD1的T細胞，這些T細胞在抗PD1治療后發(fā)生克隆性擴增，而與腫瘤亞型無關。擴增主要涉及CD8⁺T細胞（顯著表達細胞毒性、免疫細胞歸巢和耗竭標志物）和CD4⁺T細胞（表達T-helper-1和follicular-helper標志物）。

2. 在治療前活檢組織中，免疫調節(jié)性樹突狀細胞（PD-L1⁺）、特異性巨噬細胞表型（CCR2⁺、MMP9⁺）和主要組織相容性復合體I/II類表達的癌細胞的相對頻率與T細胞擴增呈正相關。

3. 未分化的前效/記憶T細胞（Tcf7⁺、GZMK⁺）或抑制性巨噬細胞（CX3CR1⁺、C3⁺）與T細胞增殖呈負相關。

這些數(shù)據(jù)分析結果確定了各種免疫表型和相關基因集，它們與抗PD１治療后T細胞擴增呈正、負相關，并闡明乳腺癌患者抗PD1治療響應的異質性特征。

參考文獻
Bassez, Ayse et al. “A single-cell map ofintratumoral changes during anti-PD1 treatment of patients with breast cancer.”Nature medicine vol. 27,5 (2021): 820-832.