單細(xì)胞技術(shù)在癌癥免疫治療中的應(yīng)用

單細(xì)胞技術(shù)正逐步成為癌癥研究的強(qiáng)大工具。通過(guò)單細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)，能夠發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)，特別是免疫治療后每個(gè)細(xì)胞的分子狀態(tài)，為理解腫瘤異質(zhì)性、微環(huán)境細(xì)胞類型組成和細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變提供了可能。對(duì)于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)來(lái)說(shuō)，分析臨床樣本非常重要，但在技術(shù)上極具挑戰(zhàn)。近日，《Nature Cancer》發(fā)表了一篇名為“From bench to bedside: single-cell analysis for cancer immunotherapy”的文章，具體描述了包括空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)學(xué)在內(nèi)的單細(xì)胞技術(shù)從樣本收集到數(shù)據(jù)分析的方法步驟，及其在癌癥治療研究中的應(yīng)用。


現(xiàn)有的，最常見(jiàn)的可用于腫瘤免疫治療研究的單細(xì)胞技術(shù)包括用于轉(zhuǎn)錄分析的單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）、用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)（CyTOF）和空間檢測(cè)技術(shù)。這些技術(shù)提供了細(xì)胞的分子圖譜，將細(xì)胞分為不同的細(xì)胞群，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞類型注釋，推測(cè)細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換以及關(guān)聯(lián)的分子通路。以此，我們可以確定驅(qū)動(dòng)每種不同細(xì)胞類型行為的途徑，并推斷與細(xì)胞狀態(tài)變化相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間相互作用。這些途徑的推論被廣泛用于當(dāng)前腫瘤免疫學(xué)的臨床研究。目前正在開發(fā)的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)策略是通過(guò)聯(lián)合療法重塑TME以提高免疫治療敏感性。這個(gè)過(guò)程中，單細(xì)胞方法有望助力精準(zhǔn)免疫治療。

目前可用于了解腫瘤的細(xì)胞組成和細(xì)胞間相互作用的幾種方法包括：
1、 單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué) (CyTOF) 提供細(xì)胞組成和細(xì)胞狀態(tài)信息。

2、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)可提供與（A）相同的分析，也可以提供細(xì)胞軌跡預(yù)測(cè)以及T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫組庫(kù)信息�？臻g技術(shù)能將細(xì)胞組成、狀態(tài)、細(xì)胞相互作用相關(guān)聯(lián)。

3、借助空間蛋白質(zhì)組學(xué)及其單細(xì)胞分辨率，可以識(shí)別單個(gè)細(xì)胞類型并確定特定的細(xì)胞間相互作用。

4、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)雖然缺乏單細(xì)胞分辨率，但可以根據(jù)不同臨近細(xì)胞之間受體和配體的分子表達(dá)預(yù)測(cè)細(xì)胞相互作用，并發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞壁龕之間的致癌途徑。

圖1：癌癥分析的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法

樣本制備

大多數(shù)非空間單細(xì)胞技術(shù)，如scRNA-seq和CyTOF，需要解離并獲得活細(xì)胞進(jìn)行分析（圖1A和1B）。最常用的樣品分離方法是酶消化。分離前的樣品儲(chǔ)存、酶的類型和孵育時(shí)間都會(huì)影響單細(xì)胞分析結(jié)果，因此必須針對(duì)每種腫瘤類型仔細(xì)優(yōu)化。而空間檢測(cè)技術(shù)是基于玻片開發(fā)的技術(shù)，該技術(shù)保留了組織結(jié)構(gòu)，無(wú)需進(jìn)行解離�？臻g蛋白質(zhì)組可以對(duì)冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣品進(jìn)行檢測(cè)（圖1C）。當(dāng)前的空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法依賴于冷凍樣本，使用FFPE樣本的方法正在開發(fā)中（圖1D，目前10X Genomics公司剛剛推出針對(duì)FFPE樣品的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)）。對(duì)FFPE保存樣品進(jìn)行檢測(cè)使得對(duì)處理后并長(zhǎng)期儲(chǔ)存的樣品進(jìn)行回顧性臨床研究成為了可能。

數(shù)據(jù)分析

1、高通量單細(xì)胞或者空間組學(xué)數(shù)據(jù)分析的常規(guī)流程如下：

2、 單細(xì)胞和空間數(shù)據(jù)分析將從原始數(shù)據(jù)預(yù)處理開始，以去除質(zhì)量差的細(xì)胞和數(shù)據(jù)；批量校正以消除由于實(shí)驗(yàn)差異導(dǎo)致的樣品間誤差；數(shù)據(jù)填充以糾正實(shí)際數(shù)據(jù)缺失。

3、降維并使用聚類工具進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化和細(xì)胞類型注釋，這些工具根據(jù)每個(gè)細(xì)胞群表達(dá)的特定marker進(jìn)行注釋。從這里開始，數(shù)據(jù)準(zhǔn)備好進(jìn)行下游分析，具體取決于應(yīng)用的方法和生物學(xué)問(wèn)題。

4、可以使用差異表達(dá)分析來(lái)識(shí)別分子改變。在轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)中，還可以進(jìn)行通路分析以確定癌癥進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)因素和對(duì)治療的反應(yīng)，以及預(yù)測(cè)細(xì)胞命運(yùn)軌跡以了解腫瘤和 TME隨時(shí)間的調(diào)節(jié)。

6、最后，通過(guò)多組學(xué)方法對(duì)相同樣本的蛋白質(zhì)和基因表達(dá)分析 或T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫組庫(kù)分析與轉(zhuǎn)錄分析相結(jié)合，可增加細(xì)胞類型注釋的準(zhǔn)確性并研究它們?cè)诎┌Y演變和治療反應(yīng)中的作用。

圖2：?jiǎn)渭?xì)胞和空間分析的數(shù)據(jù)分析流程和方法

患者腫瘤之間的異質(zhì)性以及無(wú)法在患者中測(cè)試多種治療方案進(jìn)一步挑戰(zhàn)了轉(zhuǎn)化研究中的單細(xì)胞機(jī)制研究。匯集臨床試驗(yàn)研究和來(lái)自臨床前模型的干擾研究的單細(xì)胞圖譜可以為這類研究提供重要參考。用免疫療法治療的臨床前模型的單細(xì)胞分析可以發(fā)現(xiàn)與治療反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞類型和通路，而對(duì)用相同療法治療的樣本進(jìn)行跨物種分析可以揭示哪些治療反應(yīng)是保守的。從單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中比較小鼠和人類保守反應(yīng)的新分析工具可以進(jìn)一步支持臨床前分析的模型選擇，為臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)提供信息。

圖3：從小鼠到人體的高維分析研究將推動(dòng)下一代精準(zhǔn)癌癥免疫療法

參考文獻(xiàn)來(lái)源：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.07.004