Nanoimager超分辨率成像在熒光與活細(xì)胞研究領(lǐng)域的應(yīng)用

 

我們在《Nanoimager：20nm超高分辨率技術(shù)，將細(xì)胞外囊泡行蹤盡收眼底》已經(jīng)了解，Nanoimager單分子成像與分析系統(tǒng)作為新一代超分辨率顯微鏡的標(biāo)志性代表，其克服了光的衍射極限，分辨率可達(dá)20nm，不僅可以獲得超分辨率單分子熒光圖像，進(jìn)行三維成像，同時(shí)還可以支持雙色成像和順序四色成像。這些特性使它成為信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤和外泌體標(biāo)志物、病毒增值和裝配、細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)表征等研究領(lǐng)域在單分子水平上進(jìn)行顯微分析的重要幫手。

 

Nanoimager為何如此強(qiáng)大？其背后又有哪些核心技術(shù)支撐？

 

熒光顯微成像是生物學(xué)研究的一個重要手段，但由于光學(xué)顯微鏡受到光的衍射限制，分辨率被限制在200nm左右，因此常規(guī)光學(xué)顯微鏡無法分辨尺寸在200nm以下的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。Nanoimager擁有的超分辨率技術(shù)dSTORM（隨機(jī)光學(xué)重建顯微技術(shù)）、PALM（光激活定位顯微技術(shù)）、smFRET（單分子FRET技術(shù)）、Single Particle Tracking（單分子示蹤技術(shù)）支持了Nanoimager可以在20nm的超分辨率下進(jìn)行全面的生物學(xué)研究。

 

dSTORM & PALM
 

Nanoimager擁有的dSTORM（隨機(jī)光學(xué)重建顯微技術(shù)）和PALM（光激活定位顯微技術(shù)），二者原理相似，是利用光激活方法的新型超分辨率熒光顯微技術(shù)，成像過程均需要往復(fù)循環(huán)，在每個循環(huán)周期里，熒光分子團(tuán)被連續(xù)的激活、成像及漂白，二者都通過計(jì)算（高斯擬合）實(shí)現(xiàn)高分辨率單分子定位，精度可以達(dá)到20nm，比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡分辨率提高了10倍以上，因此可以幫助用戶看到更精細(xì)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

 

dSTORM&PALM優(yōu)勢：

1. 20nm分辨率：XY軸可視化20nm結(jié)構(gòu)

2. 3D成像：Z軸分辨率達(dá)到50nm，可3D成像

3.精確定量結(jié)果：可計(jì)算分子的大小和數(shù)量分布，以及空間距離
 

皮質(zhì)神經(jīng)元突觸前后結(jié)構(gòu)成像



鼻病毒感染HeLa細(xì)胞并破壞高爾基體成像




COS-7細(xì)胞核膜和細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)成像



FFPE腎組織切片中腎小球足細(xì)胞蛋白成像



兔腰肌肌原纖維成像

 

Single Particle Tracking
 

Nanoimager具有的Single Particle Tracking單分子示蹤技術(shù)可以在兩個通道中同時(shí)跟蹤納米級的粒子，并可以計(jì)算粒子的大小和數(shù)量分布，讓熒光標(biāo)記分子或囊泡的檢測變得簡單輕松。

 

Single Particle Tracking優(yōu)勢：

活細(xì)胞成像：具有內(nèi)置的加熱控制、自動對焦和微流控設(shè)置支持，支持活細(xì)胞成像

四個熒光通道，可2個同時(shí)成像：可在一個實(shí)驗(yàn)中追蹤4種不同的分子，同時(shí)捕獲2種熒光

專有的跟蹤分析軟件：專有的NimOS軟件可實(shí)現(xiàn)自動顆粒跟蹤以及擴(kuò)散系數(shù)、顆粒大小和濃度的測量
 

Atlastin1蛋白在成纖維細(xì)胞中沿著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)行走圖像


追蹤HEK293T細(xì)胞內(nèi)流感病毒HA（HA Dendra）顆粒


內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體接觸位點(diǎn)的動態(tài)追蹤



成纖維細(xì)胞中BHV1行為的研究

可視化活細(xì)胞中EVs動力學(xué)和相互作用
 

Single-Molecule FRET


 

smFRET（單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)）是將2個相互作用的分子標(biāo)記上顏色不同的熒光基團(tuán)，一個在能量轉(zhuǎn)移過程中提供能量，即供體D(donor)，另一個接受能量，即受體A(acceptor)。然后運(yùn)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移 （FRET) 技術(shù)來對體系進(jìn)行研究，因此比單個熒光基團(tuán)標(biāo)記更具有優(yōu)勢。smFRET可以表征各種類型樣品的單分子相互作用并進(jìn)行定量。
 

 

Nanoimager是一款為數(shù)不多能夠進(jìn)行單分子FRET的商用顯微鏡。配合專有的NimOS軟件，可在2-10nm內(nèi)實(shí)時(shí)進(jìn)行納米尺操作，一次采集即可追蹤數(shù)千個FRET熒光事件，不僅可以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，也可以加快項(xiàng)目過程。

 

smFRET優(yōu)勢：

洞悉分子相互作用：確定蛋白質(zhì)分子的空間位置，識別分子相互作用、結(jié)合情況和停頓時(shí)間

大視場：可同時(shí)捕獲數(shù)千個單分子，大幅提高實(shí)驗(yàn)吞吐量

專有的smFRET分析軟件：可繪制和分組個體FRET痕跡及總體平均值

 

雙精氨酸易位（Tat）復(fù)合物的組裝
 

NimOS分析軟件

此外，Nanoimag專有的NimOS軟件在超高分辨率成像中也占據(jù)重要作用。NimOS支持用戶快速輕松地獲取并分析數(shù)據(jù)，當(dāng)用戶和同事共享顯微鏡時(shí)，也可以不必在同一臺計(jì)算機(jī)上進(jìn)行采集和分析。

 

最后，Nanoimager單分子成像與功能分析系統(tǒng)簡單易用、設(shè)計(jì)緊湊，單位面積小于A4紙。它可以始終保持校準(zhǔn)狀態(tài)，樣品準(zhǔn)備好后可以直接成像，無需花費(fèi)時(shí)間進(jìn)行調(diào)試和校準(zhǔn)。使用安全無害的一級激光，可在任何辦公室、實(shí)驗(yàn)室和教室使用，無需額外配置溫控房間、光學(xué)平臺、激光室或暗室，使用更便捷。

 

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