新冠疫苗中mRNA成分和LNP遞送系統(tǒng)的功能和特征及其對疫苗穩(wěn)定性影響

mRNA疫苗概述
 
mRNA-LNP 疫苗的組成是其穩(wěn)定性的基礎(chǔ)。在針對新冠病毒的疫苗開發(fā)過程中，已經(jīng)有多種不同的 mRNA 候選疫苗。目前，有10種不同的針對新冠的mRNA疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，包括常規(guī) mRNA疫苗和自擴(kuò)增 mRNA (SAM)。目前有三種“常規(guī)”可編碼完整的S蛋白的mRNA 疫苗已獲批或處于臨床試驗(yàn)后期。它們是 Moderna 的 mRNA-1273 疫苗、BioNTech/Pfizer 的 BNT162b2/Comirnaty 和 CureVac 的 CVnCoV（可見表1）。
 
有幾篇綜述對這三種新冠的 mRNA疫苗進(jìn)行了詳細(xì)比較，包括它們在 mRNA 結(jié)構(gòu)和LNP設(shè)計(jì)方面的差異和相似之處。以下部分旨在概述這些疫苗中mRNA 成分和 LNP遞送系統(tǒng)的功能和特征，因?yàn)樗鼈儗?mRNA 疫苗的體內(nèi)給藥和儲(chǔ)存期間的穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用。
 
表1  有關(guān)目前上市使用或臨床 III 期試驗(yàn)的三種 mRNA-LNP疫苗的信息，出于比較原因，添加了 Onpattro（一種 siRNA-LNP 藥物產(chǎn)品）的藥物產(chǎn)品信息。
 
 
* NDA 210922 ONPATTRO (patisiran) 脂質(zhì)復(fù)合物注射液；藥品質(zhì)量審查附錄（FDA，2017 年）。
a N = 可電離的陽離子脂質(zhì)（氮），P = 核苷酸（磷酸鹽）。
b推測
 
 2.1 優(yōu)化mRNA體內(nèi)穩(wěn)定性和翻譯能力的mRNA工程
 
 mRNA由于其磷酸基團(tuán)上帶有負(fù)電荷，在生理 pH 范圍內(nèi)是以聚陰離子大分子的形式存在。遞送mRNA 疫苗的第一個(gè)障礙是由于核糖核酸酶在細(xì)胞外環(huán)境中含量豐富，裸露的mRNA在注射后容易被核糖核酸酶 (RNase) 迅速降解。其次， mRNA進(jìn)入細(xì)胞會(huì)被細(xì)胞內(nèi)RNA受體識別，包括內(nèi)體Toll 樣受體 (TLR) 和細(xì)胞質(zhì)核酸受體。mRNA與這些宿主防御受體的結(jié)合會(huì)激活先天免疫通路，會(huì)導(dǎo)致數(shù)百個(gè)基因的表達(dá)。一方面，這可以為疫苗提供佐劑樣作用。另一方面，它導(dǎo)致細(xì)胞處于抗病毒狀態(tài)，這強(qiáng)烈降低了細(xì)胞內(nèi)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯表達(dá)。攝取進(jìn)入細(xì)胞后， mRNA 鏈需要與核糖體結(jié)合以實(shí)現(xiàn)所編碼蛋白質(zhì)的翻譯表達(dá)�？梢酝ㄟ^mRNA工程顯著改善mRNA 的蛋白質(zhì)合成速率和功能半衰期，mRNA疫苗中的mRNA鏈的典型元件示意圖如圖1所示。
 
圖1 體外轉(zhuǎn)錄 (IVT) mRNA 的結(jié)構(gòu)元件。這些序列中的每一個(gè)部分都可以優(yōu)化和修改，以調(diào)節(jié)mRNA 的穩(wěn)定性、翻譯能力和免疫激活能力。
 
 有很多研究嘗試提高mRNA 分子的體內(nèi)穩(wěn)定性和翻譯能力，同時(shí)避免不需要的先天免疫激活。目前達(dá)成共識的是，這可以通過優(yōu)化 mRNA 的調(diào)控區(qū)域5' 帽、poly-A 尾和非翻譯區(qū) (UTR)來實(shí)現(xiàn)。UTR位于mRNA 編碼區(qū)的兩側(cè)，可以調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯。
 
poly-A尾也能調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，因?yàn)樗�的縮短和去除都會(huì)導(dǎo)致 mRNA 的降解。5' 帽結(jié)構(gòu)對于蛋白質(zhì)生產(chǎn)和翻譯啟動(dòng)子的結(jié)合很重要。此外，具有最大化 GC（鳥嘌呤-胞嘧啶）含量的mRNA 結(jié)合密碼子優(yōu)化，即在編碼區(qū)選擇“常用密碼子”，可提高穩(wěn)定性和翻譯水平。
 
 
 
另一個(gè)關(guān)鍵因素是mRNA的二級結(jié)構(gòu)，它可以通過密碼子優(yōu)化和計(jì)算工具來改變一級序列使其穩(wěn)定。通過選擇“高度結(jié)構(gòu)化的編碼序列”在mRNA中構(gòu)建二級結(jié)構(gòu) （除了5' UTR 區(qū)域）也會(huì)產(chǎn)生更高的體內(nèi)翻譯水平，因?yàn)閙RNA體內(nèi)半衰期得到延長。或者，Mauger等人證明天然存在的修飾尿苷的引入，例如使用1-甲基-假尿苷（m1Ψ）代替尿苷，會(huì)帶來mRNA二級結(jié)構(gòu)的整體變化，從而達(dá)到更高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)。
 
重要的是，目前將RNA結(jié)合蛋白對mRNA的胞內(nèi)識別降至最低的最有效方法是在mRNA中引入這些修飾的尿苷，這些蛋白參與對外來mRNA的先天免疫反應(yīng)，反過來增強(qiáng)了生物穩(wěn)定性和翻譯能力，同時(shí)降低了mRNA 疫苗的免疫原性。此外，還有跡象表明，m1Ψ 提高了mRNA 的堿基堆積和熔點(diǎn)，從而使mRNA更加穩(wěn)定。
 
這可能意味著 Moderna 和 BioNTech/Pfizer 的新冠疫苗，1mΨ的摻入也會(huì)提高給藥前mRNA 的穩(wěn)定性。最近有文章發(fā)表了對 CureVac在 CVnCoV mRNA 工程中所做工作的有趣分析，CureVac 采用了不同的策略。然而，即使優(yōu)化了mRNA的結(jié)構(gòu)，直接注射裸露的mRNA 也不會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，這可能是因?yàn)槁懵兜膍RNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染能力差和對RNA酶（RNase）敏感。這說明僅優(yōu)化mRNA結(jié)構(gòu)不足以創(chuàng)建有效的 mRNA 疫苗，仍然需要額外的保護(hù)和遞送系統(tǒng)。
 
另一種類型的 mRNA 疫苗SAMs不僅編碼目標(biāo)抗原，還編碼RNA 聚合酶——來自病毒的“自我放大”因子。通常，SAMs由 9 kb 的mRNA核苷酸組成，而非自我復(fù)制的mRNA疫苗的序列長度僅為2-4 kb。開發(fā) SAM 候選疫苗的目的是替代典型的兩劑策略的“啟動(dòng)-加強(qiáng)”方案，而是達(dá)到每位接種者單次注射。由于自帶的復(fù)制能力，SAM疫苗的注射劑量低于傳統(tǒng)mRNA疫苗，一劑便可能達(dá)到足夠保護(hù)效力。
 
當(dāng) SAM 在宿主細(xì)胞中被翻譯時(shí)，一種RNA聚合酶合成與編碼mRNA 模板互補(bǔ)的反義RNA中間體，再轉(zhuǎn)錄為許多編碼mRNA 分子，從而使抗原表達(dá)延長和增強(qiáng)。目前兩種 SAM 疫苗都編碼完整的S 蛋白，并且這些疫苗在臨床試驗(yàn)中的最高劑量比常規(guī)mRNA 疫苗的典型劑量低十倍以上。臨床開發(fā)中的兩種SAM 疫苗是倫敦帝國理工學(xué)院的nCoVsaRNA 和 Arcturus/Duke-NUS 的 ARCT-021，兩種疫苗均采用的是LNP包裹技術(shù)。