iTRAQ/TMT標記定量蛋白質(zhì)組在非小細胞癌轉(zhuǎn)移機制新解研究中的應(yīng)用
百趣生物iTRAQ/TMT標記定量蛋白質(zhì)組研究是對一個基因組表達的全部蛋白質(zhì)或一個復雜混
體系內(nèi)所有蛋白質(zhì)進行標記，利用標記試劑中的二級報告離子來對蛋白進行精確鑒定和定量。接下來就跟著阿趣一起解讀吧。
體系內(nèi)所有蛋白質(zhì)進行標記，利用標記試劑中的二級報告離子來對蛋白進行精確鑒定和定量。接下來就跟著阿趣一起解讀吧。
文章標題：Profilin 1 Induces Tumor Metastasis byPromoting Microvesicle Secretion Through the ROCK 1/p-MLC Pathway in Non-SmallCell Lung Cancer
發(fā)表期刊：Frontiers in Pharmacology
發(fā)表時間：2022.5
影響因子：5.988
合作單位：中南大學湘雅醫(yī)院
百趣生物提供服務(wù)：TMT標記蛋白組
01摘要
Profilin 1(PFN1)是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，在幾種癌癥的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著不同的作用；然而，其在非小細胞肺癌(NSCLC)轉(zhuǎn)移中的作用仍不清楚。作者應(yīng)用TMT標記定量蛋白組技術(shù)研究其誘導腫瘤轉(zhuǎn)移的機制。蛋白質(zhì)組學分析顯示PFN1參與微泡(MV)分泌。與非轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的血清相比，轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的血清中MV的豐度增加。體外和體內(nèi)實驗均表明，PFN1可以增加MV分泌，并且源自PFN1過表達細胞的MV顯著促進NSCLC轉(zhuǎn)移。同樣發(fā)現(xiàn)PFN1可以與ROCK1相互作用并增強其激酶活性以促進肌球蛋白輕鏈(MLC)磷酸化從而促進MV分泌。ROCK1的抑制降低了MV的分泌并部分逆轉(zhuǎn)了PFN1誘導的NSCLC轉(zhuǎn)移的促進作用�？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明PFN1調(diào)節(jié)MV分泌以促進NSCLC轉(zhuǎn)移。PFN1和MV代表了NSCLC轉(zhuǎn)移的潛在預測因子或治療靶點。
02實驗結(jié)果 1.PFN1與NSCLC 轉(zhuǎn)移相關(guān)，可促進NSCLC細胞體外遷移
為了研究PFN1在NSCLC中的作用，作者采用IHC方法、組織芯片定量等實驗，表明了PFN1參與了NSCLC的轉(zhuǎn)移，并構(gòu)建細胞系，通過RT-qPCR和Western檢測過表達和敲除的影響，后又采用傷口愈合和Transwell遷移試驗來確定PFN1對遷移的影響。
圖1. NSCLC組織PFN1的IHC分析圖像/Kaplan–Meier生存分析
2.PFN1可促進NSCLC中Mv的分泌
為了進一步研究EV和PFN1 OE細胞之間的分子差異以及影響NSCLC的可能信號通路。作者利用基于蛋白質(zhì)組學的方法（TMT定量蛋白質(zhì)組學）描述它們之間的蛋白質(zhì)水平。差異蛋白質(zhì)（DEPs）篩選條件為P值<0.05和倍數(shù)變化≤0.83或倍數(shù)變化≥1.2。結(jié)果確定了581個差異蛋白質(zhì)，其中327個上調(diào)的蛋白質(zhì)和254個下調(diào)的蛋白質(zhì)（圖2）。
圖2. 差異表達蛋白分析熱圖
接下來，利用富集分析來確定這些DEPs是否可以指向任何特定的生物學功能，從而可以深入了解它們在生物學功能上的差異。GO注釋表明DEPs涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、細胞成分組織或生物發(fā)生和細胞器組織（圖3）。大多數(shù)不同表達的蛋白與細胞器相關(guān)，這與PFN1在細胞膜運輸中的作用相一致。同源蛋白群簇(COG/KOG)分析顯示，DEPs參與了翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶蛋白、細胞內(nèi)運輸、分泌、囊泡轉(zhuǎn)運和信號轉(zhuǎn)導機制（圖4）。通過蛋白質(zhì)組學分析，我們推斷PFN1可能通過蛋白相互作用和信號轉(zhuǎn)導參與細胞外囊泡分泌，進而促進NSCLC轉(zhuǎn)移。
圖3. 差異表達蛋白的GO富集分析
圖4. 差異表達蛋白的COG／KOG分析
由于PFN1在細胞膜運輸中起著重要作用，而MVs是癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵介質(zhì)，我們從臨床樣本的血清中提取了細胞外囊泡(MVs和外泌體)。通過一系列實驗，發(fā)現(xiàn)PFN1可能調(diào)控MLC的磷酸化，而磷酸化可以調(diào)節(jié)MV的分泌。
3.來自PFN1OE細胞的MVs促進了NSCLC細胞的遷移
Mv是癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵介質(zhì)。作者收集了轉(zhuǎn)移性（n=25）和非轉(zhuǎn)移性（n=20）肺癌患者的血清樣本，并提取了Mv（圖5）。作者通過一系列過表達，以及傷口愈合和Transwell遷移實驗，發(fā)現(xiàn)PFN1可能通過誘導MV分泌促進NSCLC轉(zhuǎn)移。
圖5. 為確定PFN1在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用而建立的轉(zhuǎn)移瘤小鼠模型示意圖
4.PFN1通過提高MV的分泌來促進體內(nèi)NSCLC的轉(zhuǎn)移
為了進一步研究PFN1在NSCLC轉(zhuǎn)移中的作用，我們通過心內(nèi)注射H1299NSCLC細胞建立了腫瘤轉(zhuǎn)移的小鼠模型，結(jié)果進一步證實了PFN1在NSCLC轉(zhuǎn)移中的作用（圖6）。
為了進一步研究PFN1在NSCLC轉(zhuǎn)移中的作用，我們通過心內(nèi)注射H1299NSCLC細胞建立了腫瘤轉(zhuǎn)移的小鼠模型，結(jié)果進一步證實了PFN1在NSCLC轉(zhuǎn)移中的作用（圖6）。
圖6. HE染色小鼠模型肺組織的代表性圖像/肺組織中PFN1和p-MLC表達
5.PFN1促進MLC磷酸化的機制
作者通過敲低、過表達、co-IP、Western blot、免疫熒光、流式細胞術(shù)等實驗，發(fā)現(xiàn)PFN1可以與ROCK1相互作用，增強其激酶活性，并間接促進MLC磷酸化，最終誘導MV分泌。ROCK1抑制劑Y27632部分逆轉(zhuǎn)了PFN1促進MLC磷酸化和MV分泌的作用（圖7）。
作者通過敲低、過表達、co-IP、Western blot、免疫熒光、流式細胞術(shù)等實驗，發(fā)現(xiàn)PFN1可以與ROCK1相互作用，增強其激酶活性，并間接促進MLC磷酸化，最終誘導MV分泌。ROCK1抑制劑Y27632部分逆轉(zhuǎn)了PFN1促進MLC磷酸化和MV分泌的作用（圖7）。
圖7. western印跡法測定PFN1過度表達(A)/敲除(B)后的蛋白表達/PF
6.ROCK1抑制劑Y27632在體內(nèi)和體外均部分逆轉(zhuǎn)了PFN1對NSCLC轉(zhuǎn)移的影響
創(chuàng)面愈合實驗顯示（圖8），Y27632處理的過表達PFN1的細胞遷移減少到接近EV細胞.接下來，將過表達PFN1的細胞來源的MVs添加到y(tǒng)27632處理的細胞中，發(fā)現(xiàn)Y27632并沒有逆轉(zhuǎn)過表達PFN1的細胞來源的MVs誘導的遷移，從Transwell遷移實驗中也得到了類似的結(jié)果，此外也用小鼠模型驗證了這些結(jié)果。
創(chuàng)面愈合實驗顯示（圖8），Y27632處理的過表達PFN1的細胞遷移減少到接近EV細胞.接下來，將過表達PFN1的細胞來源的MVs添加到y(tǒng)27632處理的細胞中，發(fā)現(xiàn)Y27632并沒有逆轉(zhuǎn)過表達PFN1的細胞來源的MVs誘導的遷移，從Transwell遷移實驗中也得到了類似的結(jié)果，此外也用小鼠模型驗證了這些結(jié)果。
圖8. 傷口愈合實驗評估Y27632的療效
03總結(jié)
研究結(jié)果表明，PFN1是關(guān)鍵的肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)控肌動蛋白細胞骨架的關(guān)鍵蛋白之一，它通過ROCK/p-MLC通路促進MV的釋放，從而促進NSCLC的轉(zhuǎn)移。因此，PFN1可能是NSCLC轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點。通過減少MVs的釋放，有可能會部分逆轉(zhuǎn)PFN1過表達誘導的NSCLC細胞遷移。本研究為靶向轉(zhuǎn)移治療NSCLC提供了一種潛在的新方法，值得進一步研究。
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文/阿趣代謝組學
標簽：
蛋白組學
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