用非靶向與靶向代謝組學(xué)識別不同炎癥性哮喘表型患者痰液代謝組學(xué)特征
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下面跟著小趣一起，透過「痰液代謝組學(xué)」認(rèn)識不同炎癥亞型哮喘吧。
近日，四川大學(xué)華西醫(yī)院王剛教授團(tuán)隊(duì)在Allergy Asthma & Immunology Research（IF=5.096）上發(fā)表了題為"Sputum Metabolomic Profiling Reveals Metabolic Pathways and Signatures Associated With Inflammatory Phenotypes in Patients With Asthma"的論文。
四川大學(xué)華西醫(yī)院王剛教授是論文第一通訊作者，劉影博士是論文第一作者；上海百趣代謝組學(xué)技術(shù)研究中心創(chuàng)始團(tuán)隊(duì)劉志鵬研究員和研究人員王洪光為論文共同作者。百趣生物為本次研究提供了非靶向代謝組學(xué)+靶向代謝組學(xué)服務(wù)。
哮喘是一種嚴(yán)重的全球性慢性炎癥性氣道疾病，其特點(diǎn)是氣道高反應(yīng)性和可逆性氣道阻塞導(dǎo)致的反復(fù)發(fā)作的喘息、氣短、胸悶和咳嗽。同時，哮喘也是一種具有不同表型和內(nèi)型的異質(zhì)性疾病，其中哮喘的炎癥表型（嗜酸性粒細(xì)胞性哮喘[EA]、中性粒細(xì)胞性哮喘[NA]和少粒細(xì)胞性哮喘[PGA]）根據(jù)誘導(dǎo)的痰粒細(xì)胞不同比例而被廣泛認(rèn)知。
盡管可以為不同炎癥表型的患者量身定制管理方法，但針對特定炎癥表型，尤其是NA的治療策略尚且缺乏，這代表了哮喘的醫(yī)療需求有待被滿足。同時，驅(qū)動哮喘不同炎癥表型的分子機(jī)制知之甚少，并且可能是異質(zhì)的。因此，識別特定的生物標(biāo)志物并了解哮喘不同炎癥表型的分子機(jī)制非常重要，這可能會導(dǎo)致更加個性化的醫(yī)療。
本研究通過非靶向與靶向代謝組學(xué)方法，以識別不同炎癥性哮喘表型患者的痰液代謝組學(xué)特征和潛在的分子途徑，以期探索這些特征是否與控制哮喘和加重哮喘風(fēng)險相關(guān)。
一、樣本設(shè)置
發(fā)現(xiàn)集（discovery set）119個痰液樣本：
驗(yàn)證集（validation set）114個痰液樣本：
二、臨床特征
驗(yàn)證集中，炎癥細(xì)胞因子結(jié)果顯示在哮喘表型中，EA患者的IL-5水平最高，而TNF-α、IL-1β、IL-8水平最低（p<0.05）。與之相反，NA組IL-1β水平最高，IL-5水平最低（均P<0.05）（表1）。在12個月的隨訪中，有3例（10%）NA患者和3例（6.1%）PGA患者失訪。最后，108例哮喘患者（EA,n=35；NA,n=27；PGA,n=46）納入哮喘加重分析。結(jié)果顯示，不同表型組中，嚴(yán)重哮喘發(fā)作的患者比例（EA vs NA vs PGA:17.1% vs 37% vs 6.5%,P=0.004）和嚴(yán)重哮喘發(fā)作次數(shù)的頻率（EAvsNA vs PGA: 0.29±0.75 vs 0.70±1.33 vs 0.09±0.35,P=0.004）存在顯著差異（表1）。
表1. 數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差、數(shù)字(%)或中位數(shù)（下四分位數(shù)、上四分位數(shù)）。EA，嗜酸性粒細(xì)胞性哮喘；NA，中性粒細(xì)胞性哮喘；PGA，少粒細(xì)胞哮喘；BMI，體重指數(shù)；BDP，二丙酸倍氯米松；LTRA，白三烯受體拮抗劑；SPT，皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)；ACQ，哮喘控制問卷；AQLQ，哮喘生活質(zhì)量問卷；FEV1，一秒用力呼氣量；FVC，用力肺活量；BDR，支氣管擴(kuò)張劑反應(yīng)；FeNO，呼出的一氧化氮分?jǐn)?shù)；IgE，免疫球蛋白E；TNF，腫瘤壞死因子；干擾素，干擾素；IL，白細(xì)胞介素；MDC，巨噬細(xì)胞衍生的趨化因子。與EA組比, aP<0.01, bP<0.05; 與NA組相比, cP<0.01, dP<0.05。
三、非靶向代謝譜可區(qū)分發(fā)現(xiàn)集中不同炎癥性哮喘表型和健康受試者
OPLS-DA分析表明不同哮喘炎癥表型之間明顯分離。此外，哮喘組也與健康對照組明顯分開（圖1）。每個模型中Q2截距的低值表明這些模型的穩(wěn)健性，因此在所有比較中顯示過擬合的風(fēng)險較低，組間差異顯著。
圖1. 發(fā)現(xiàn)集中，非靶向代謝譜在不同炎癥表型哮喘和健康受試者中有所區(qū)別。(A-D) 不同炎癥性哮喘表型和健康受試者的PCA模型評分圖；(E-H) 不同炎癥性哮喘表型與健康受試者OPLS-DA模型的評分圖；(I-L) 不同炎癥性哮喘表型與健康受試者OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn)
結(jié)合單變量和多變量統(tǒng)計分析，基于OPLS-DA模型的VIP>1、倍數(shù)變化<0.83或>1.2和FDR<0.05，在不同的哮喘表型和健康受試者之間共發(fā)現(xiàn)77種差異代謝物（圖2）。
應(yīng)用MetPA代謝組學(xué)通路拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)富集分析方法來評估不同哮喘表型和健康受試者中病理生理機(jī)制潛在途徑的重要性（圖3）。結(jié)果顯示，組氨酸代謝途徑在哮喘組和健康對照組之間存在差異（P=0.019；影響值=0.189）。EA和NA之間的差異代謝物富集在甘油磷脂代謝（P=0.015；影響值=0.121）、煙酸和煙酰胺代謝（P=0.020；影響值=0.332）和組氨酸代謝（P=0.022；影響值=0.189）。EA和PGA之間的差異代謝物富集在甘油磷脂代謝（P=0.001；沖擊值=0.186）、亞油酸代謝（P=0.001；影響值=1.000）、組氨酸代謝（P=0.014；影響值=0.189）和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成（P=0.046；影響值=0.500）。NA和PGA之間的差異代謝物富集在亞油酸代謝（P=0.002；影響值=1.000）、甘油磷脂代謝（P=0.010；影響值=0.160）和煙酸、煙酰胺代謝（P=0.015；影響值=0.332）。
圖3. 基于能區(qū)分不同炎癥表型哮喘和健康受試者痰樣本的代謝物的代謝通路分析。(A) 哮喘與健康；(B) EA和NA；(C) EA和PGA；(D) NA和PGA。圓圈表示可能涉及類分離的代謝途徑。EA，嗜酸性哮喘；NA，中性粒細(xì)胞哮喘；PGA, 少粒細(xì)胞性哮喘。
五、靶向定量驗(yàn)證集中不同炎癥性哮喘表型與健康受試者之間的差異代謝物
經(jīng)過文獻(xiàn)調(diào)研和靶標(biāo)定量方法檢測分析評估，選擇了39個差異表達(dá)代謝物，在驗(yàn)證集患者中進(jìn)行靶向定量，其中24種代謝物在哮喘炎癥表型之間顯著差異表達(dá)（表2），其中9種代謝物的顯著P值為0.001或更低。組胺以及組氨酸代謝相關(guān)代謝物的表達(dá)量最高，而5-L-谷氨酰基-L-丙氨酸、煙酰胺、二氫胸腺嘧啶、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、丙氨酰亮氨酸、苯丙氨酰絲氨酸、苯丙氨酰苯丙氨酸在EA患者中表達(dá)量最低。這些數(shù)據(jù)與代謝通路拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)富集分析結(jié)果一致，表明組氨酸代謝可能在EA中起重要作用。在NA患者中，涉及嘌呤代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、牛磺酸和亞�；撬岽x以及氨酰tRNA生物合成的腺苷5'-單磷酸、甘油酸、牛磺酸、二氫胸腺嘧啶、L-亮氨酸、酪胺、L-谷氨酸、丙氨酰亮氨酸、苯丙氨酰絲氨酸和蘇氨酰苯丙氨酸的濃度最高，而甘油磷脂代謝相關(guān)代謝物甘油磷酸膽堿的濃度最低，與之相反，PGA中甘油磷膽堿的濃度最高。而且，PGA患者的不飽和脂肪酸相關(guān)代謝產(chǎn)物，十七烷酸和油酸的生物合成也最高，但十二烷酸的濃度最低（表2）。
表2. 數(shù)值表示為中位數(shù)（下四分位數(shù)、上四分位數(shù)）。EA，嗜酸性粒細(xì)胞性哮喘；NA，中性粒細(xì)胞性哮喘；PGA，少粒細(xì)胞哮喘。與EA組比, aP<0.01, bP<0.05; 與NA組相比, cP<0.01, dP<0.05。
此外，通過受試者工作特征（ROC）曲線檢測這些差異表達(dá)的代謝物，以區(qū)分不同的炎癥哮喘表型。�；撬�、丙氨酰亮氨酸、苯丙氨酰絲氨酸和蘇氨酰苯丙氨酸可作為鑒別NA與EA或PGA的候選代謝標(biāo)記物，其AUC范圍為0.816~0.975（P<0.05）（圖4）。然而，由于單一代謝物的AUC均小于0.7，故不能有效區(qū)分EA和PGA。
圖4. 區(qū)分NA和EA (A) 或NA和PGA (B) 的代謝物受試者工作特征（ROC）曲線。EA，嗜酸性哮喘；NA，中性粒細(xì)胞哮喘；PGA, 少粒細(xì)胞性哮喘。
六、驗(yàn)證集中差異代謝物與臨床指標(biāo)和炎癥特征的相關(guān)性
相關(guān)性分析顯示，差異表達(dá)的代謝物與所有哮喘受試者的肺功能、哮喘控制和炎癥特征相關(guān)（圖5）。在12個月的隨訪中，使用logistic回歸和負(fù)二項(xiàng)回歸模型探討所有哮喘患者痰液代謝物與嚴(yán)重哮喘發(fā)作之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，腺苷5'-單磷酸與嚴(yán)重哮喘加重顯著相關(guān)（表3）。校正年齡、性別、BMI和FEV1%之后，腺苷5'-單磷酸與經(jīng)歷嚴(yán)重哮喘發(fā)作的患者比例以及嚴(yán)重哮喘發(fā)作頻率呈正相關(guān)(RRadj=1.000,95%CI=[1.000,1.000],P=0.050；RRadj=1.000,95%CI=[1.000,1.000],P=0.008)。同時，尿囊素和煙酰胺與嚴(yán)重哮喘發(fā)作頻率均呈正相關(guān)(RRadj=1.000,95%CI=[1.000,1.000],P=0.043；RRadj=1.001,95%CI=[1.000,1.002],P=0.021)。此外，對嗜酸性哮喘(EA)或非嗜酸性哮喘(NEA)進(jìn)行了亞組分析。結(jié)果顯示，腺苷5'-單磷酸仍與NEA組的嚴(yán)重哮喘惡化顯著相關(guān)，但與EA組無關(guān)。而且，我們還發(fā)現(xiàn)腺嘌呤、別胱硫醚和煙酰胺也與NEA組嚴(yán)重哮喘發(fā)作顯著相關(guān)。然而，由于EA組的樣本量有限，只發(fā)現(xiàn)酪胺與嚴(yán)重哮喘發(fā)作的頻率相關(guān)。
圖5. 驗(yàn)證集中所有哮喘受試者差異代謝物與臨床和炎癥特征相關(guān)性熱圖。FEV1，一秒用力呼氣量；FVC，用力肺活量；ACQ，哮喘控制問卷；AQLQ，哮喘生活質(zhì)量問卷；FeNO，呼出的一氧化氮分?jǐn)?shù)；IgE，免疫球蛋白 E；TNF，腫瘤壞死因子；干擾素，干擾素；IL，白細(xì)胞介素；MDC，巨噬細(xì)胞衍生的趨化因子。
表3. 根據(jù)年齡、性別、BMI和FEV1進(jìn)行了校正。OR，優(yōu)勢比；CI，置信區(qū)間；BMI，體重指數(shù)；FEV1，一秒用力呼氣量。
七、結(jié)論
不同炎癥性哮喘表型的代謝組學(xué)研究分析可以發(fā)現(xiàn)，不同亞型間累計有77個差異顯著代謝物變化和5條差異顯著代謝通路變化。這些代謝組學(xué)通路主要是組氨酸代謝、甘油磷脂代謝、煙酸和煙酰胺代謝、亞油酸代謝、以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成。此外，還發(fā)現(xiàn)差異代謝物與哮喘的臨床和炎癥特征相關(guān)，這些代謝物可能能夠作為不同炎癥性哮喘表型的潛在治療靶點(diǎn)。
文/阿趣代謝組學(xué)
下面跟著小趣一起，透過「痰液代謝組學(xué)」認(rèn)識不同炎癥亞型哮喘吧。
近日，四川大學(xué)華西醫(yī)院王剛教授團(tuán)隊(duì)在Allergy Asthma & Immunology Research（IF=5.096）上發(fā)表了題為"Sputum Metabolomic Profiling Reveals Metabolic Pathways and Signatures Associated With Inflammatory Phenotypes in Patients With Asthma"的論文。
哮喘是一種嚴(yán)重的全球性慢性炎癥性氣道疾病，其特點(diǎn)是氣道高反應(yīng)性和可逆性氣道阻塞導(dǎo)致的反復(fù)發(fā)作的喘息、氣短、胸悶和咳嗽。同時，哮喘也是一種具有不同表型和內(nèi)型的異質(zhì)性疾病，其中哮喘的炎癥表型（嗜酸性粒細(xì)胞性哮喘[EA]、中性粒細(xì)胞性哮喘[NA]和少粒細(xì)胞性哮喘[PGA]）根據(jù)誘導(dǎo)的痰粒細(xì)胞不同比例而被廣泛認(rèn)知。
盡管可以為不同炎癥表型的患者量身定制管理方法，但針對特定炎癥表型，尤其是NA的治療策略尚且缺乏，這代表了哮喘的醫(yī)療需求有待被滿足。同時，驅(qū)動哮喘不同炎癥表型的分子機(jī)制知之甚少，并且可能是異質(zhì)的。因此，識別特定的生物標(biāo)志物并了解哮喘不同炎癥表型的分子機(jī)制非常重要，這可能會導(dǎo)致更加個性化的醫(yī)療。
本研究通過非靶向與靶向代謝組學(xué)方法，以識別不同炎癥性哮喘表型患者的痰液代謝組學(xué)特征和潛在的分子途徑，以期探索這些特征是否與控制哮喘和加重哮喘風(fēng)險相關(guān)。
一、樣本設(shè)置
發(fā)現(xiàn)集（discovery set）119個痰液樣本：
驗(yàn)證集（validation set）114個痰液樣本：
二、臨床特征
驗(yàn)證集中，炎癥細(xì)胞因子結(jié)果顯示在哮喘表型中，EA患者的IL-5水平最高，而TNF-α、IL-1β、IL-8水平最低（p<0.05）。與之相反，NA組IL-1β水平最高，IL-5水平最低（均P<0.05）（表1）。在12個月的隨訪中，有3例（10%）NA患者和3例（6.1%）PGA患者失訪。最后，108例哮喘患者（EA,n=35；NA,n=27；PGA,n=46）納入哮喘加重分析。結(jié)果顯示，不同表型組中，嚴(yán)重哮喘發(fā)作的患者比例（EA vs NA vs PGA:17.1% vs 37% vs 6.5%,P=0.004）和嚴(yán)重哮喘發(fā)作次數(shù)的頻率（EAvsNA vs PGA: 0.29±0.75 vs 0.70±1.33 vs 0.09±0.35,P=0.004）存在顯著差異（表1）。
三、非靶向代謝譜可區(qū)分發(fā)現(xiàn)集中不同炎癥性哮喘表型和健康受試者
OPLS-DA分析表明不同哮喘炎癥表型之間明顯分離。此外，哮喘組也與健康對照組明顯分開（圖1）。每個模型中Q2截距的低值表明這些模型的穩(wěn)健性，因此在所有比較中顯示過擬合的風(fēng)險較低，組間差異顯著。
結(jié)合單變量和多變量統(tǒng)計分析，基于OPLS-DA模型的VIP>1、倍數(shù)變化<0.83或>1.2和FDR<0.05，在不同的哮喘表型和健康受試者之間共發(fā)現(xiàn)77種差異代謝物（圖2）。
圖2. 發(fā)現(xiàn)組中不同炎癥表型哮喘和健康受試者痰樣本中差異代謝物熱圖
四、發(fā)現(xiàn)集中的代謝組學(xué)通路分析應(yīng)用MetPA代謝組學(xué)通路拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)富集分析方法來評估不同哮喘表型和健康受試者中病理生理機(jī)制潛在途徑的重要性（圖3）。結(jié)果顯示，組氨酸代謝途徑在哮喘組和健康對照組之間存在差異（P=0.019；影響值=0.189）。EA和NA之間的差異代謝物富集在甘油磷脂代謝（P=0.015；影響值=0.121）、煙酸和煙酰胺代謝（P=0.020；影響值=0.332）和組氨酸代謝（P=0.022；影響值=0.189）。EA和PGA之間的差異代謝物富集在甘油磷脂代謝（P=0.001；沖擊值=0.186）、亞油酸代謝（P=0.001；影響值=1.000）、組氨酸代謝（P=0.014；影響值=0.189）和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成（P=0.046；影響值=0.500）。NA和PGA之間的差異代謝物富集在亞油酸代謝（P=0.002；影響值=1.000）、甘油磷脂代謝（P=0.010；影響值=0.160）和煙酸、煙酰胺代謝（P=0.015；影響值=0.332）。
五、靶向定量驗(yàn)證集中不同炎癥性哮喘表型與健康受試者之間的差異代謝物
經(jīng)過文獻(xiàn)調(diào)研和靶標(biāo)定量方法檢測分析評估，選擇了39個差異表達(dá)代謝物，在驗(yàn)證集患者中進(jìn)行靶向定量，其中24種代謝物在哮喘炎癥表型之間顯著差異表達(dá)（表2），其中9種代謝物的顯著P值為0.001或更低。組胺以及組氨酸代謝相關(guān)代謝物的表達(dá)量最高，而5-L-谷氨酰基-L-丙氨酸、煙酰胺、二氫胸腺嘧啶、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、丙氨酰亮氨酸、苯丙氨酰絲氨酸、苯丙氨酰苯丙氨酸在EA患者中表達(dá)量最低。這些數(shù)據(jù)與代謝通路拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)富集分析結(jié)果一致，表明組氨酸代謝可能在EA中起重要作用。在NA患者中，涉及嘌呤代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、牛磺酸和亞�；撬岽x以及氨酰tRNA生物合成的腺苷5'-單磷酸、甘油酸、牛磺酸、二氫胸腺嘧啶、L-亮氨酸、酪胺、L-谷氨酸、丙氨酰亮氨酸、苯丙氨酰絲氨酸和蘇氨酰苯丙氨酸的濃度最高，而甘油磷脂代謝相關(guān)代謝物甘油磷酸膽堿的濃度最低，與之相反，PGA中甘油磷膽堿的濃度最高。而且，PGA患者的不飽和脂肪酸相關(guān)代謝產(chǎn)物，十七烷酸和油酸的生物合成也最高，但十二烷酸的濃度最低（表2）。
此外，通過受試者工作特征（ROC）曲線檢測這些差異表達(dá)的代謝物，以區(qū)分不同的炎癥哮喘表型。�；撬�、丙氨酰亮氨酸、苯丙氨酰絲氨酸和蘇氨酰苯丙氨酸可作為鑒別NA與EA或PGA的候選代謝標(biāo)記物，其AUC范圍為0.816~0.975（P<0.05）（圖4）。然而，由于單一代謝物的AUC均小于0.7，故不能有效區(qū)分EA和PGA。
六、驗(yàn)證集中差異代謝物與臨床指標(biāo)和炎癥特征的相關(guān)性
相關(guān)性分析顯示，差異表達(dá)的代謝物與所有哮喘受試者的肺功能、哮喘控制和炎癥特征相關(guān)（圖5）。在12個月的隨訪中，使用logistic回歸和負(fù)二項(xiàng)回歸模型探討所有哮喘患者痰液代謝物與嚴(yán)重哮喘發(fā)作之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，腺苷5'-單磷酸與嚴(yán)重哮喘加重顯著相關(guān)（表3）。校正年齡、性別、BMI和FEV1%之后，腺苷5'-單磷酸與經(jīng)歷嚴(yán)重哮喘發(fā)作的患者比例以及嚴(yán)重哮喘發(fā)作頻率呈正相關(guān)(RRadj=1.000,95%CI=[1.000,1.000],P=0.050；RRadj=1.000,95%CI=[1.000,1.000],P=0.008)。同時，尿囊素和煙酰胺與嚴(yán)重哮喘發(fā)作頻率均呈正相關(guān)(RRadj=1.000,95%CI=[1.000,1.000],P=0.043；RRadj=1.001,95%CI=[1.000,1.002],P=0.021)。此外，對嗜酸性哮喘(EA)或非嗜酸性哮喘(NEA)進(jìn)行了亞組分析。結(jié)果顯示，腺苷5'-單磷酸仍與NEA組的嚴(yán)重哮喘惡化顯著相關(guān)，但與EA組無關(guān)。而且，我們還發(fā)現(xiàn)腺嘌呤、別胱硫醚和煙酰胺也與NEA組嚴(yán)重哮喘發(fā)作顯著相關(guān)。然而，由于EA組的樣本量有限，只發(fā)現(xiàn)酪胺與嚴(yán)重哮喘發(fā)作的頻率相關(guān)。
七、結(jié)論
不同炎癥性哮喘表型的代謝組學(xué)研究分析可以發(fā)現(xiàn)，不同亞型間累計有77個差異顯著代謝物變化和5條差異顯著代謝通路變化。這些代謝組學(xué)通路主要是組氨酸代謝、甘油磷脂代謝、煙酸和煙酰胺代謝、亞油酸代謝、以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成。此外，還發(fā)現(xiàn)差異代謝物與哮喘的臨床和炎癥特征相關(guān)，這些代謝物可能能夠作為不同炎癥性哮喘表型的潛在治療靶點(diǎn)。
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