腎透明細(xì)胞癌致瘤機(jī)制：KDM5C基因缺失致使糖原代謝重編和抑制鐵死亡

腎透明細(xì)胞癌致瘤機(jī)制：KDM5C基因缺失致使糖原代謝重編和抑制鐵死亡

文章標(biāo)題：Deficiency of the X-inactivation escaping gene KDM5C in clear cell renal cell carcinoma promotes tumorigenicity by reprogramming glycogen metabolism and inhibiting ferroptosis

發(fā)表期刊：Theranostics

發(fā)表時(shí)間：2021.08.04

影響因子：11.556

合作客戶(hù)：武漢大學(xué)

百趣生物提供的服務(wù)：PPP、EMP靶標(biāo)代謝流代謝組學(xué)檢測(cè)

研究背景
腎透明細(xì)胞癌 (ccRCC) 是最常見(jiàn)的腎癌形式，病癥表現(xiàn)為富含脂質(zhì)和糖原的細(xì)胞質(zhì)沉積物增加。研究表明，ccRCC中諸多基因位點(diǎn)發(fā)生突變，其中VHL基因和染色質(zhì)修飾基因KDM5C。盡管已證明VHL缺失可導(dǎo)致糖原累積，X染色體上KDM5C基因失活逃逸導(dǎo)致男性為主要患者，但其潛在機(jī)制仍不清楚。

此外，ccRCC患者存活率較低可能與磷酸戊糖途徑(PPP)的上調(diào)有關(guān)，因此糖原代謝可以作為治療靶點(diǎn)，但是，ccRCC中糖原累積和相關(guān)致癌功能的遺傳因素尚不完全清楚。

本文利用全外顯子組與RNA測(cè)序評(píng)估KDM5C在ccRCC中的功能，結(jié)合靶標(biāo)代謝組學(xué)代謝流研究KDM5C如何影響細(xì)胞內(nèi)代謝通量。同時(shí)還對(duì)小鼠進(jìn)行KDM5C基因敲除收集更多的體內(nèi)證據(jù)，揭示了組蛋白修飾基因失活突變重編程糖原代謝的機(jī)制，并有助于解決人類(lèi)癌癥中男性占主導(dǎo)地位的長(zhǎng)期難題。

研究?jī)?nèi)容
具有最高糖原水平的 ccRCC 細(xì)胞系存在著 KDM5C 基因移碼突變

對(duì)ccRCC 6個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行高碘酸-希夫 (PAS) 染色和糖原定量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，相比于其他同樣缺乏 VHL基因的癌細(xì)胞系，RCC4表現(xiàn)出最高的糖原水平（圖1 A、B）。此外，外顯子測(cè)序結(jié)果表明RCC4細(xì)胞中KDM5C和VHL出現(xiàn)移碼和錯(cuò)義突變，WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)RCC4細(xì)胞中不存在KDM5C和VHL蛋白（圖1 C、D），由此表明癌細(xì)胞中的高糖原水平可能與KDM5C突變有關(guān)。

為了驗(yàn)證KDM5C的恢復(fù)是否會(huì)降低RCC4細(xì)胞中的糖原水平，構(gòu)建了野生型KDM5C或其酶失活突變體H514A的RCC4細(xì)胞系，PAS染色結(jié)果和糖原定量測(cè)定結(jié)果表明KDM5C能有效降低糖原水平（圖1 E、F），KDM5C突變促進(jìn)ccRCC中糖原的形成。

鑒于KDM5C是X失活逃逸基因，作者分析不同性別的患者的情況，發(fā)現(xiàn)在ccRCC中頻繁突變的基因中，KDM5C突變表現(xiàn)出最高的男女比例（圖1 G），KDM5C蛋白水平在ccRCC患者中下降，同時(shí)糖原顯著增加（圖1 H），這就解釋了為什么ccRCC患者大部分為男性。

圖1. X失活逃逸基因KDM5C在糖原水平最高的ccRCC細(xì)胞系中具有移碼突變

KDM5C缺失引起ccRCC特異性代謝組學(xué)表型

為了證實(shí)KDM5C缺失導(dǎo)致ccRCC發(fā)生和糖原積累，作者進(jìn)行KDM5C敲除實(shí)驗(yàn)。在對(duì)照組中，雌性腎臟中的KDM5C蛋白水平高于雄性（圖2 A）。相比于對(duì)照組，在50%的KDM5C敲除小鼠中觀察到腎囊腫（圖2 B），其管腔的上皮細(xì)胞顯示出強(qiáng)Ki67染色（圖2 C），KDM5C敲除小鼠的腎小管表現(xiàn)出細(xì)胞質(zhì)糖原累積升高（圖2 D）, 表明KDM5C缺失可能引發(fā)ccRCC特異性代謝組學(xué)表型并促進(jìn)腫瘤形成。另外，KDM5C敲除穩(wěn)定細(xì)胞系的PAS染色和糖原定量結(jié)果均表明KDM5C耗盡后糖原水平增加（圖2 E-H）。

圖2. KDM5C敲除引發(fā)ccRCC特異性代謝表型

為了明確VHL和KDM5C兩者在糖原累積作用的聯(lián)系，作者另外對(duì)Caki-1細(xì)胞進(jìn)行敲除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)VHL和KDM5C任何一種缺失都會(huì)導(dǎo)致糖原累積，二者同時(shí)敲除存在累加效應(yīng)，表明KDM5C可能具有獨(dú)立于VHL/HIF的調(diào)節(jié)糖原的能力。（圖3）

圖3. 構(gòu)建的caki-1細(xì)胞系的糖原水平

KDM5C組蛋白去甲基化酶活性是其在調(diào)節(jié)參與糖生成、糖原分解和PPP的基因表達(dá)的作用所必需的

為了探索KDM5C在糖原代謝中的作用機(jī)制，作者對(duì)ACHN-shKDM5C、 RCC4-KDM5C細(xì)胞系以及對(duì)照組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)KDM5C基因與中樞代謝、HIF反應(yīng)、氨基糖代謝和轉(zhuǎn)錄失調(diào)相關(guān)，表明KDM5C對(duì)細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)至關(guān)重要（圖4 A、B）。除此之外，鑒定了幾個(gè)參與糖原合成/降解和PPP的基因，包括HK2、GYS1、PGM1、PPP1R3C以及控制葡萄糖向PPP流動(dòng)的關(guān)鍵基因G6PD，這些基因均在KDM5C敲除后表現(xiàn)出高表達(dá)，由此表明KDM5C可能會(huì)抑制ccRCC細(xì)胞中的HIF基因表達(dá)和葡萄糖向PPP分流（圖4 C-E）。

WB結(jié)果表明KDM5C表達(dá)會(huì)降低基因啟動(dòng)子的H3K4me3水平（圖4 F），且KDM5C敲除會(huì)導(dǎo)致除了PPP1R3C之外的那些基因的啟動(dòng)子上H3K4me3的水平增加（圖4 G），表明KDM5C能夠直接調(diào)節(jié)HK2、GYS1、PGM1和G6PD的基因表達(dá)。由此得到一個(gè)結(jié)論：KDM5C缺失導(dǎo)致H3K4me3水平提升進(jìn)而促進(jìn)糖原相關(guān)基因的表達(dá)。
 

圖4. KDM5C 抑制糖原代謝需要組蛋白去甲基化酶活性

KDM5C抑制葡萄糖向PPP的流動(dòng)

盡管上述結(jié)果表明KDM5C可以同時(shí)調(diào)節(jié)糖原代謝和PPP，但其具體調(diào)控的方向仍不清楚。于是作者利用靶標(biāo)代謝組學(xué)代謝流技術(shù)確認(rèn)KDM5C抑制了葡萄糖向PPP的流動(dòng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在恢復(fù)KDM5C的RCC4細(xì)胞中，G6P、6-PG、R5P、EMP的F6P和乳酸的同位素信號(hào)顯著減弱（圖5 A）,表明KDM5C抑制了葡萄糖向PPP的流動(dòng)和糖酵解。此外，細(xì)胞內(nèi)代謝物定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)RCC4中的G6P水平高于其他ccRCC細(xì)胞系（圖5 B），KDM5C抑制了參與PPP和糖酵解的幾種產(chǎn)物的產(chǎn)生（圖5 C和D）。

百趣生物了解到，有趣的是，KDM5C同樣有效降低了G6P和NADPH的水平（圖5 E）, 盡管VHL降低了糖原含量，但未能降低G6P和NADPH的水平。與其他代謝物類(lèi)似，KDM5C突變降低GSH水平。同樣，KDM5C缺失導(dǎo)致ccRCC細(xì)胞系的PPP底物G6P、PPP產(chǎn)物NADPH和GSH增加（圖4 F）。
 

圖5. KDM5C通過(guò)戊糖磷酸途徑抑制葡萄糖通量

KDM5C主要通過(guò)促進(jìn)鐵死亡來(lái)抑制致瘤性

PPP在抗ROS活性和腫瘤侵襲上具有重大意義，其中間產(chǎn)物NADPH是鐵死亡的指標(biāo)。為了明確KDM5C在ROS抗性和鐵死亡中的潛在作用，作者通過(guò)ROS誘導(dǎo)處理來(lái)比較各種ccRCC細(xì)胞系ROS抗性。與其他ccRCC細(xì)胞系相比，RCC4表現(xiàn)出相對(duì)較高的ROS抗性（圖6 A）。在用TBHP處理后，與RCC4-H514A細(xì)胞相比，RCC4-KDM5C有更多的細(xì)胞死亡（圖6 B）。同時(shí)，在TBHP誘導(dǎo)下，KDM5C導(dǎo)致ROS水平顯著增加（圖6 C）。此外，KDM5C顯著增強(qiáng)了Erastin介導(dǎo)的細(xì)胞死亡（圖6 B），這可以被Ferr-1或DFO有效逆轉(zhuǎn)，但不能被Z-VAD或Nec-1s逆轉(zhuǎn)。因此，與RCC4-H514A細(xì)胞相比，RCC4-KDM5C細(xì)胞中Erastin誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化增加更明顯（圖6 D）。
 

圖6. KDM5C主要通過(guò)抑制鐵死亡來(lái)抑制致瘤性

KDM5C敲除賦予癌細(xì)胞對(duì)ROS和鐵死亡的抵抗力

敲除KDM5C后，與幾種ccRCC細(xì)胞系對(duì)TBHP和Erastin的抵抗力顯著增強(qiáng)（圖7 A、B）。值得注意的是，在糖原磷酸化酶抑制劑(GPI)會(huì)抑制其抗性（圖7 C），這表明KDM5C蛋白介導(dǎo)的糖原重編程的缺失對(duì)于抗ROS和鐵死亡是必不可少的。
 

圖7. KDM5C的缺失使老化的腎細(xì)胞和ccRCC細(xì)胞對(duì)鐵死亡具有抗性

癌癥相關(guān)的KDM5C突變?cè)谝种铺窃�積累和促進(jìn)鐵死亡方面存在缺陷

測(cè)序鑒定到大部分突變?cè)贘mjN和JmjC結(jié)構(gòu)域中富集（圖8 A），為了評(píng)估這些癌癥相關(guān)的KDM5C突變對(duì)糖原積累和鐵死亡的影響，選擇了幾個(gè)JmjN和JmjC結(jié)構(gòu)域相關(guān)的錯(cuò)義突變，并構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)突變蛋白的相應(yīng)RCC4細(xì)胞系（圖8 A）。有趣的是，所有這些突變體都表現(xiàn)得像H514A，不能有效地降低糖原和G6P水平（圖8 B），并且它們都沒(méi)有使細(xì)胞對(duì)鐵死亡或ROS誘導(dǎo)劑敏感（圖8 C)。
 

圖8. 臨床相關(guān)的KDM5C突變體未能降低糖原水平并抑制鐵死亡

基于前面的結(jié)果，百趣生物發(fā)現(xiàn)作者提出了ccRCC中失活KDM5C突變的模型。如圖9所示，雌性KDM5C有兩個(gè)活性等位基因；因此，在單個(gè)基因改變后，雌性不會(huì)完全喪失基因。相比之下，在男性中，一個(gè)腎細(xì)胞突變使KDM5C基因的唯一等位基因失活，從而可能通過(guò)增加糖原生成/糖原分解和抑制鐵死亡來(lái)促進(jìn)腫瘤發(fā)生。因此，男性更容易患ccRCC。
 

圖9. 失活KDM5C突變和ccRCC發(fā)病模型

結(jié) 論
該文章揭示了組蛋白修飾基因KDM5C失活突變重編程糖原代謝和隨后的PPP，并誘導(dǎo)了鐵死亡抗性，從而擴(kuò)展了KDM5C功能庫(kù)，這些功能對(duì)于ccRCC的腫瘤發(fā)生至關(guān)重要，有助于解釋人類(lèi)癌癥中男性占主導(dǎo)地位的長(zhǎng)期難題。此外，該研究結(jié)果可能表明在ccRCC中靶向糖原代謝的治療價(jià)值。

文/阿趣代謝組學(xué)