代謝組學(xué)助力研究證實長時間萎凋?qū)Π撞柚蟹宇惢�合物等有顯著影響

文章標題：Impact of prolonged withering on phenolic compounds and antioxidant capability in white tea using LC-MS-based metabolomics and HPLC analysis: Comparison with green tea

發(fā)表期刊：Food Chemistry

發(fā)表時間：2021.8

影響因子：7.514

合作單位：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)普洱茶學(xué)院

百趣生物提供服務(wù)：發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)—親水版

研究背景
茶是世界上最受歡迎和廣泛消費的飲品之一。如果將中國茶葉按照加工工藝進行劃分，可分為綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶、紅茶、黑茶六類。在中國河南省的信陽地區(qū)，生長著信陽品種茶葉，可以用于生產(chǎn)綠茶、白茶、紅茶和黑茶。由于白茶具有特殊的品質(zhì)和多種有益的作用，目前研究對探討了白茶的健康功效和化學(xué)成分十分關(guān)注，并證實了白茶化學(xué)成分介于綠茶和紅茶之間，但是綠茶和白茶之間的化學(xué)成分和抗氧化能力的差異尚未明確和定義。本文旨在采用LC-MS非靶向代謝組學(xué)，比較加工工藝和生產(chǎn)季節(jié)因素對白茶和綠茶代謝物的影響。并進一步采用鐵還原能力(FRAP)、ABTS自由基清除能力(ABTS)、羥基自由基清除能力(HSA)和DPPH清除能力(DPPH) 4種方法評價白茶的體外抗氧化活性。

通過研究加工工藝和生產(chǎn)季節(jié)對茶的生物活性成分、代謝組學(xué)代謝物成分和抗氧化能力的影響，文章揭示了綠茶和白茶在化學(xué)成分和抗氧化活性方面存在明顯差異，并證實了長時間萎凋?qū)Π撞柚蟹宇惢�合物、氨基酸、糖和嘌呤生物堿有著顯著影響。

研究結(jié)果
1加工工藝和生產(chǎn)季節(jié)對酚類化合物和嘌呤生物堿的影響
 

圖1. 茶樣中的生物活性化合物分析

根據(jù)加工工藝不同，將茶葉樣本分為綠茶（GT）和白茶（WT）兩組，再按生產(chǎn)季節(jié)將同樣的樣本分為春茶（ST）和夏秋茶（SFT）。

根據(jù)HPLC技術(shù)對20種生物活性化合物進行檢測，PCA（圖1A）和HCA（圖1B）的結(jié)果體現(xiàn)出綠茶和白茶兩組之間存在顯著差異，所以依據(jù)加工工藝實現(xiàn)茶葉分類，對綠茶和白茶樣本進行區(qū)分是可行的。此外，HCA顯示春季生產(chǎn)的白茶可以單獨歸為一組，與夏秋季生產(chǎn)的白茶有著明顯區(qū)分，這證實了生產(chǎn)季節(jié)確實會明顯影響白茶的化學(xué)成分。熱圖（圖1C）結(jié)果將20個化學(xué)成分分為2類。在第I類成分中，白茶的6種黃酮類、咖啡因和茶堿的含量相對高于綠茶。而在第II類成分中，綠茶的兒茶素8種、酚酸2種、1，4，6-三烷基β-D-葡萄糖（GG）和可可堿的含量相對較高。

加工工藝使得綠茶和白茶之間有15種化合物呈顯著差異（p<0.05，p<0.01，或p<0.001），包括6種兒茶素、2種酚酸、4種黃酮碘、GG和2種嘌呤生物堿。與綠茶相比，白茶有6種兒茶素（C、EC、ECG、GCG、CG和EGCG）、2種酚酸（GA和EA）、GG和可可堿含量較低，但4種黃酮類物質(zhì)和咖啡因含量顯著升高（p<0.05）�？傮w而言，結(jié)果表明，白茶的長時間萎凋促進了兒茶素和酚酸的降解，同時促進了黃酮類化合物和嘌呤生物堿的積累。

生產(chǎn)季節(jié)對兒茶素和類黃酮化合物的影響顯著。與春茶相比，夏秋茶中4種兒茶素和3種黃酮類化合物的水平均有顯著性增加，特別是EGC、山奈酚和楊梅素（p<0.001）。溫度越高和光照強度越強促進了夏秋茶中兒茶素和黃酮類化合物的積累。

2茶的整體代謝組學(xué)代謝物分布特征分析

圖2. 茶樣中的整體代謝物分析

通過對非靶向代謝組學(xué)檢測到的1189種代謝組學(xué)代謝物進行分析，PCA和HCA的結(jié)果同樣體現(xiàn)出綠茶與白茶組之間差異明顯，加工工藝是良好的分類準則，能夠?qū)⒉璺譃榫G茶組和白茶組（圖2）。在PCA中可以了解到，春茶與夏秋茶也存在明顯差異。而在HCA中，春季生產(chǎn)的白茶與綠茶聚集在一起（圖2B），表示它們在化學(xué)成分上有高度相似性。盡管加工工藝和生產(chǎn)季節(jié)都影響著茶葉的化學(xué)成分，但結(jié)果來看大部分綠茶還是難以依據(jù)生產(chǎn)季節(jié)進行分類。
 

圖3. 加工工藝和生產(chǎn)季節(jié)對茶中代謝物的影響
 

綠茶與白茶的對比結(jié)果中，有179種分化代謝物（圖3C）的FC值小于0.1，表明白茶的長時間萎凋有助于特定代謝物的積累或產(chǎn)生，如游離氨基酸、類黃酮苷和茶黃素。KEGG代謝途徑分析，強調(diào)了加工工藝和生產(chǎn)季節(jié)會顯著影響氨基酸代謝，黃酮和黃酮醇的生物合成，以及類黃酮的生物合成。

3白茶的萎凋?qū)Υ�謝組學(xué)代謝物成分的影響

圖4. 熱圖展示綠茶和白茶之間的顯著差異代謝物，酚類化合物(A)、氨基酸、糖和嘌呤生物堿(B)

在代謝組檢測到的1189種代謝物中，59種酚類化合物和45種氨基酸及其衍生物存在差異顯著（VIP>1、p<0.05和FC>1.50或FC<0.66）。這可能是由于白茶萎凋時間長，部分保留了酶活性，如多酚氧化酶、漆酶和過氧化物酶。從熱圖（圖4）結(jié)果上可以看出，綠茶和白茶之間酚類化合物、氨基酸、糖和嘌呤生物堿有著一定差異。

a)酚類化合物
如圖4A所示，兩種白茶中茶黃素、茶黃素3、3’-雙甲酸酯和異茶黃素3’-沒食子酸酯等茶黃素含量迅速升高，比綠茶高2.67-9.01倍，而大部分兒茶素水平顯著下降。長時間萎凋?qū)е铝税�括酯類兒茶素在�?nèi)的兒茶素極顯著的下降，黃酮類物質(zhì)的顯著上調(diào)證實發(fā)酵和酶水解促進類黃酮的產(chǎn)量，如皇后素和山奈酚。后續(xù)白茶加工過程中黃酮類和黃酮苷的代謝機制有待進一步研究。

b)氨基酸
以往的研究表明，綠茶中總游離氨基酸和幾種游離氨基酸的含量較高。在紅茶酶促發(fā)酵和紅茶微生物發(fā)酵過程中，游離氨基酸總含量均呈下降趨勢。由于在白茶過程中蛋白質(zhì)的降解，白茶比綠茶和紅茶含有更豐富的游離氨基酸。

相比之下（圖4），白茶中亮氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的趨勢顯著下降， 而其他游離氨基酸顯示顯著增加，特別是異亮氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和纈氨酸等增加了2倍以上，其中顯著增加的代謝物主要來自于左-多巴3‘-葡萄糖苷的水解。此外，白茶中γ-氨基丁酸的含量顯著高于綠茶，其原因并不是由于在厭氧處理下的多胺降解途徑產(chǎn)生γ-氨基丁酸大量積累，γ-氨基丁酸主要是由谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸產(chǎn)生的。

c)糖和嘌呤生物堿
在代謝組學(xué)檢測到的39種糖類中，有4種糖類含量在白茶中顯著降低，特別是4-葡萄糖醛酸大幅下降。另外由于白茶在長時間萎凋過程中，纖維素和半纖維素發(fā)生了降解，使得有12種糖類的含量顯著增加，且白茶中咖啡因含量也呈上升趨勢。由于咖啡因的氧化，茶堿、7-三甲基尿酸也顯著升高，此外其他嘌呤生物堿、7-甲基黃嘌呤和3-甲基黃嘌呤均呈下降趨勢。

4茶的抗氧化能力及其與生物活性物質(zhì)的相關(guān)性
本研究采用FRAP、ABTS、DPPH和HSA4種抗氧化性檢測實驗，對茶的抗氧化活性進行了評價。綠茶和白茶之間，除HSA無顯著性差異外，F(xiàn)RAP、ABTS和DPPH（圖5a）結(jié)果都顯示了顯著差異。而且白茶則DPPH值顯著高，這應(yīng)該是由于白茶和綠茶中兒茶素、酚類酸和類黃酮等酚類化合物的差異所致。
 

圖5. 綠茶和白茶的抗氧化活性及其與生物活性化合物的相關(guān)性分析
 

除了EGCG被認為是茶中最強的抗氧化劑外，GA和黃酮類物質(zhì)，如山奈酚也有助于茶的體外抗氧化能力。雙變量相關(guān)性分析（圖5B）發(fā)現(xiàn)C、EC、EGC、ECG、CG、EGCG等兒茶素類物質(zhì)與FRAP和ABTS呈顯著正相關(guān)。

此外，山奈酚和杉木素與DPPH呈正相關(guān)，據(jù)此推測山奈酚和杉木素等類黃酮類物質(zhì)能夠提高白茶的DPPH自由基清除能力。GA對抗氧化活性有一定的影響，與FRAP呈顯著正相關(guān)，但和DPPH呈負相關(guān)的情況�？Х纫蚝涂煽蓧A與FRAP、DPPH和HSA呈一定關(guān)聯(lián)，顯示嘌呤生物堿也影響抗氧化能力。正是這些化學(xué)成分使得綠茶和白茶的抗氧化活性差異顯著。

結(jié)論
通過對河南信陽地區(qū)所產(chǎn)茶的研究，本文證實了加工工藝是影響化學(xué)成分的主要因素，可以根據(jù)加工工藝將茶葉劃分為綠茶和白茶。春季生產(chǎn)的白茶與綠茶的化學(xué)成分相似，并且白茶長時間萎凋會導(dǎo)致茶葉成分發(fā)生顯著差異變化，而這些特征成分和差異的代謝物可用于茶葉生產(chǎn)季節(jié)和加工工藝的鑒定。

結(jié)合白茶的抗氧化能力檢測實驗，發(fā)現(xiàn)綠茶和白茶的生物活性成分、代謝組學(xué)代謝物成分和抗氧化能力存在明顯差異，白茶的長時間萎凋?qū)ζ浠瘜W(xué)成分和抗氧化活性有著顯著影響。

文/阿趣代謝組學(xué)