低濃度阿拉特津（ATZ）誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖的生物標(biāo)志物

文章標(biāo)題：Integrated metabolomics and transcriptomics analysis reveals new biomarkers and mechanistic insights on atrazine exposures in MCF‑7 cells
發(fā)表期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
發(fā)表時(shí)間：2022年1月
影響因子：6.291
合作客戶：農(nóng)科院質(zhì)標(biāo)所

百趣生物提供服務(wù)：非靶標(biāo)代謝組學(xué)檢測(cè)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè)

1、研究背景
阿特拉津(ATZ)是一種世界范圍內(nèi)廣泛使用的除草劑，廣泛用于防治高粱、玉米、棉花等作物種植中的禾本科雜草。人類可以通過(guò)飲用水和飲食等途徑暴露ATZ。前期研究表明，ATZ可在較低的濃度下促進(jìn)MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖，但其相關(guān)機(jī)制尚不清楚。本研究利用多組學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)闡明環(huán)境相關(guān)濃度下ATZ暴露對(duì)MCF-7增殖的影響及可能的分子機(jī)制，為內(nèi)分泌干擾物引起的毒性機(jī)制提供新見(jiàn)解。

2、研究結(jié)果
（1）不同濃度ATZ對(duì)MCF-7的增殖效應(yīng)

通過(guò)CCK8試驗(yàn)研究不同濃度（100pM-100μM）ATZ對(duì)MCF-7細(xì)胞暴露48h后的活力影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，10 nM-100μM ATZ暴露48h后細(xì)胞活力顯著增加，其中1μM ATZ暴露后細(xì)胞存活率最高，達(dá)到149.3%（圖1）。后續(xù)試驗(yàn)選擇1μM作為代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析的暴露濃度。
 

圖1. 不同濃度ATZ對(duì)MCF‑7細(xì)胞暴露48h后活力的影響

（2）基于代謝組學(xué)揭示ATZ暴露對(duì)MCF-7代謝的影響
利用UHPLC-QTOF/MS對(duì)細(xì)胞內(nèi)代謝物進(jìn)行代謝組學(xué)分析，研究ATZ暴露后代謝譜的變化。在POS和NEG中分別鑒定到957種和1013種代謝物。百趣解讀，作者使用OPLS-DA分析，在正負(fù)電離模式下，對(duì)照組和ATZ暴露組之間存在明顯差異，表明MCF-7細(xì)胞的代謝組學(xué)特征在ATZ暴露48小時(shí)后受到明顯干擾（圖2）。
 

圖2. POS和NEG離子模式下的OPLS-DA

百趣解讀，火山圖顯示了ATZ暴露組和對(duì)照組之間代謝組學(xué)差異代謝物的分布。如圖3所示，在ESI+和ESI-模式下，93和58種代謝物上調(diào)（紅色圓圈），27和54種代謝物下調(diào)（藍(lán)色圓圈），其他代謝物沒(méi)有顯著變化（灰色圓圈）。
 

圖3. ATZ暴露組和對(duì)照組在正離子模式(A)和負(fù)離子模式(B)下的火山圖

（3）潛在生物標(biāo)志物鑒定及代謝通路分析
利用京都基因、基因組百科全書(shū)(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)和人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)(HMDB)搜索，根據(jù)VIP值和P值篩選到34種顯著變化的代謝物，主要包括維生素、氨基酸、脂肪酸及其相應(yīng)的衍生物。使用MetaboAnalyst對(duì)差異代謝物（DM）進(jìn)行代謝組學(xué)代謝通路分析，分別在ESI+和ESI-模式下鑒定到9個(gè)和8個(gè)代謝途徑（圖4）。這些代謝途徑的改變主要包括維生素代謝組學(xué)通路（葉酸一碳代謝、生物素代謝、維生素B6代謝、硫胺素代謝）、氨基酸代謝組學(xué)通路（甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、賴氨酸生物合成代謝和賴氨酸降解代謝）和脂質(zhì)代謝組學(xué)通路（甘油磷脂代謝，花生四烯酸代謝）。
 

圖4. 在ESI+(A)和ESI‑模式(B)下ATZ暴露顯著影響MCF‑7細(xì)胞的通路

（4）轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示ATZ對(duì)基因表達(dá)的影響
RNASeq結(jié)果表明，ATZ暴露后對(duì)MCF7細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)產(chǎn)生了影響�；鹕綀D展示了暴露于1µM ATZ后與對(duì)照相比差異基因（DEG）的分布，如圖5A所示。在p<0.05和log2FoldChange＞0的條件下共有1784個(gè)上調(diào)基因和1329個(gè)下調(diào)基因。顯著富集的GO主要與細(xì)胞成分有關(guān)（如圖5B所示）。KEGG通路富集分析顯示，百趣解讀，DEG主要富集于癌癥通路和癌癥蛋白聚糖（如圖5C，D所示）。
 

圖5. ATZ暴露MCF-7后轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

（5）DM和DEG的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析
百趣解讀，為了進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)錄組水平的代謝反應(yīng)機(jī)制，使用Cytoscape（v3.6.1）構(gòu)建了ATZ誘導(dǎo)的分子相互作用網(wǎng)絡(luò)。在該網(wǎng)絡(luò)中，F(xiàn)TCD(亞胺甲基轉(zhuǎn)移酶環(huán)化脫氨酶)和葉酸通過(guò)葉酸一碳代謝表現(xiàn)出最顯著的變化（如圖6所示）。葉酸一碳代謝支持細(xì)胞分裂中的多種生理過(guò)程，如10-甲酰5,6,7,8-四氫葉酸(THF)合成。THF是葉酸在體內(nèi)的主要形式，ATZ暴露導(dǎo)致的FTCD的下調(diào)可減緩THF的代謝，而MTHFD1表達(dá)的增加有助于10-甲酰THF合成和嘌呤合成的增加。葉酸和不同形式的THF參與嘌呤的合成，這與MCF-7細(xì)胞增殖過(guò)程中需要大量核苷酸是一致的。
 

圖6. DM和DEG的網(wǎng)絡(luò)分析

此外，ATZ對(duì)DNA甲基化發(fā)生了重要影響，這一過(guò)程受其底物(蛋氨酸和半胱氨酸)、輔因子(葉酸、維生素B12和維生素B6)和中間體(SAM、SAH和同型半胱氨酸)的調(diào)節(jié)。與百趣生物非靶向代謝組學(xué)鑒定出的4種顯著變化的代謝物，葉酸、吡哆醛（維生素B6的組成成分之一）、1‑脫氧‑D‑木酮糖5‑磷酸和S‑腺苷‑L‑高半胱氨酸的結(jié)果一致（如圖7）。葉酸和吡哆醛可作為ATZ暴露的生物標(biāo)志物。
 

圖7.由葉酸、7,8‑二氫葉酸  (DHF)、5,6,7,8‑四氫葉酸(THF)和反式硫化途徑組成的單碳代謝途徑

3、研究結(jié)論
百趣解讀，本研究利用多組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)闡明環(huán)境相關(guān)濃度下ATZ暴露對(duì)MCF-7增殖的分子機(jī)制。基于代謝組學(xué)分析，共鑒定出34種顯著變化的代謝物，包括維生素、氨基酸、脂肪酸和相應(yīng)的衍生物。葉酸和吡哆醛為ATZ暴露的潛在生物標(biāo)志物，葉酸一碳代謝組學(xué)通路為顯著改變的代謝途徑。最后，代謝變化中的關(guān)鍵代謝物和相關(guān)差異表達(dá)基因調(diào)控共同揭示了ATZ暴露后MCF-7細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。該研究為理解內(nèi)分泌干擾物的毒性效應(yīng)提供了新的見(jiàn)解。

文/阿趣代謝組學(xué)