單細(xì)胞核RNA測(cè)序揭示膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)展過(guò)程中的免疫圖譜

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma，GBM）是一種不可治愈的原發(fā)性惡性腦癌，具有較高的基因組和細(xì)胞間異質(zhì)性。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者平均生存期短（14個(gè)月），患者間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性對(duì)GBM靶向和免疫治療方法的成功開(kāi)發(fā)提出了巨大挑戰(zhàn)，因此深入了解GBM細(xì)胞與其免疫微環(huán)境之間的相互作用至關(guān)重要。

本文中，作者采用scRNA-seq技術(shù)研究了單細(xì)胞分辨率下小鼠GBMs的免疫和非免疫組成，并對(duì)起始和進(jìn)展過(guò)程中的人群進(jìn)行了縱向分析，為GBM治療的研究提供了潛在的細(xì)胞和分子靶點(diǎn)。

 

文章詳情

文章題目：Single-cell RNA sequencing reveals evolution of immune landscape during glioblastoma progression

中文題目：?jiǎn)渭?xì)胞核RNA測(cè)序：揭示膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)展過(guò)程中的免疫景觀演變

發(fā)表時(shí)間：2022.05

期刊名稱(chēng)：Nature Immunology

影響因子：31.25

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：scRNA-seq、bulk RNA-seq、qPCR

DOI：10.1038/s41590-022-01215-0

 

研究?jī)?nèi)容

1、scRNA-seq在GBM中識(shí)別腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞

研究首先通過(guò)scRNA測(cè)序確定GBM中的細(xì)胞類(lèi)型，包括非免疫細(xì)胞群（CD45-）以及免疫細(xì)胞群（CD45+），在CD45-細(xì)胞群中通過(guò)Johnson-Verhaak命名法標(biāo)記了腫瘤細(xì)胞群（EGFR+）；通過(guò)marker基因的表達(dá)量進(jìn)一步對(duì)CD45-以及CD45+細(xì)胞群進(jìn)行分層類(lèi)聚，確定了Oligodendrocytes(Mog，Plp1)，Microglia(P2ry12，Tmem119)，Astrocytes(Aqp4)以及Perivascular macrophages(Cd163，Mrc1)等細(xì)胞類(lèi)型。

# Fig.1 scRNA-seq鑒定GBM中CD45-和CD45+細(xì)胞群

 

2、不同轉(zhuǎn)錄特性的EGFR+細(xì)胞定位

為了確定5個(gè)轉(zhuǎn)錄不同的EGFR+腫瘤細(xì)胞簇分布的基礎(chǔ)，研究者確定了EGFR+細(xì)胞的數(shù)量和面積，結(jié)果顯示從隨著時(shí)間的推移，多個(gè)EGFR+單細(xì)胞到小的獨(dú)立簇到一個(gè)可觀測(cè)量的進(jìn)展，并且早期和晚期腫瘤中存在多個(gè)克隆。Monocle3擬時(shí)序分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，簇10產(chǎn)生了組成簇0、22和24的細(xì)胞，而簇5則為獨(dú)立來(lái)源。并且集群0/10和5/24的EGFR信號(hào)傳導(dǎo)模式是不同的，在0/10簇的細(xì)胞中Tgfα表達(dá)增加，而5/24簇細(xì)胞中Hbegf表達(dá)增加 (Tgfα和Hbegf是在癌癥不同信號(hào)通路中發(fā)揮作用的EGFR配體）。在0/10和5簇的細(xì)胞中表達(dá)差異最大的基因分別是Pdgfra和Lgals1(GaL1)，為了更好地定義這兩個(gè)細(xì)胞群體EGFR下游的信號(hào)差異，研究者進(jìn)一步進(jìn)行了bulk RNAseq、GO富集分析以及Reactome分析，結(jié)果顯示在PDGFRA+細(xì)胞群中，上調(diào)的基因涉及少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化，并且EGFR+PDGFRA+細(xì)胞中的神經(jīng)元系統(tǒng)、突觸功能和突觸處的蛋白質(zhì)相互作用明顯增強(qiáng)。

# Fig.2 GBMs由轉(zhuǎn)錄特性不同的EGFR+癌細(xì)胞群體組成的

 

3、GBMs含有一個(gè)增殖的小膠質(zhì)細(xì)胞種群--顯示出促炎特性

小膠質(zhì)細(xì)胞簇19的G2M和S期細(xì)胞周期基因表達(dá)水平較高。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在GBM進(jìn)展期間GBM小鼠EdU+小膠質(zhì)細(xì)胞在GBM組織中特異性增殖。EdU+GBM小膠質(zhì)細(xì)胞含有與有絲分裂、細(xì)胞周期相關(guān)的上調(diào)基因，EdU-小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子反應(yīng)等有關(guān)的基因。在GBM中，循環(huán)小膠質(zhì)細(xì)胞與非循環(huán)小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組具有差異，后者與促炎極化有關(guān)，并且GBM會(huì)刺激遠(yuǎn)處小膠質(zhì)細(xì)胞。擬時(shí)序分析發(fā)現(xiàn)簇2由簇4分化的觀點(diǎn)，進(jìn)一步分析兩簇差異基因，發(fā)現(xiàn)簇4是更活躍的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬群。綜上所述，在GBM腫瘤微環(huán)境(TME)中，存在一個(gè)小膠質(zhì)細(xì)胞亞群通過(guò)增強(qiáng)促炎反應(yīng)對(duì)腫瘤做出應(yīng)答。

# Fig.3 EGFR GBMs中存在增殖的小膠質(zhì)細(xì)胞

 

4、大多數(shù)GBM細(xì)胞因子來(lái)源于瘤內(nèi)免疫細(xì)胞

通過(guò)RTqPCR分析小鼠GBMs CD45+和CD45-中的32種細(xì)胞因子的表達(dá)，結(jié)果顯示大部分細(xì)胞因子在CD45+細(xì)胞中表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)檢查點(diǎn)轉(zhuǎn)錄本也在CD45+細(xì)胞群中表達(dá)，具體主要在T細(xì)胞和髓系細(xì)胞中表達(dá)�？傊�，這些結(jié)果表明，檢查點(diǎn)受體除了存在于T細(xì)胞外，還存在于先天免疫細(xì)胞；大多數(shù)瘤內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)更多來(lái)自CD45+細(xì)胞，較少來(lái)自癌細(xì)胞。

# Fig.4細(xì)胞因子、檢查點(diǎn)受體及其配體主要在瘤內(nèi)CD45+免疫細(xì)胞中表達(dá)

 

5、腫瘤進(jìn)展過(guò)程中GBM TME的縱向演變

通過(guò)RNAseq顯示，EGFR+細(xì)胞在早期和晚期GBMs中顯著增加。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞類(lèi)型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期小膠質(zhì)細(xì)胞占比高，而晚期巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加；隨著時(shí)間推移，GBMA中對(duì)側(cè)腦組織中巨噬、淋巴、單核和NK細(xì)胞明顯減少。細(xì)胞擬時(shí)序分析顯示，簇9來(lái)源于簇12，并且僅出現(xiàn)在GBM中。簇12富含少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘化和分化發(fā)育相關(guān)基因，簇9優(yōu)先表達(dá)有氧呼吸功能基因，表明新衍生的少突膠質(zhì)細(xì)胞能量需求發(fā)生變化。

# Fig.5免疫細(xì)胞浸潤(rùn)隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化

 

6、在GBM進(jìn)展過(guò)程中先天免疫的變化

與正常大腦相比，早期GBM中小膠質(zhì)細(xì)胞簇2中促炎生物標(biāo)志物以及中性粒細(xì)胞趨化及吞噬作用的表達(dá)，表明早期GBM激活小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎反應(yīng)。隨著時(shí)間推移進(jìn)展，BAM（13）獲得了中性粒細(xì)胞趨化、血管生成和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞失去促炎極化。

# Fig.6 隨時(shí)間推移，巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞失去促炎極化

 

7、TMZ調(diào)節(jié)PMN-MDSCs、巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，延長(zhǎng)生存期

高劑量的TMZ可能會(huì)通過(guò)增加小膠質(zhì)細(xì)胞以及減少PMN-MDSCs和巨噬細(xì)胞的抑制群體，促進(jìn)一種促炎表型，然而這并不足以誘導(dǎo)腫瘤清除，這表明缺乏適應(yīng)性反應(yīng)和耐藥性機(jī)制的發(fā)展。

# Fig.7 TMZ改變GBM免疫微環(huán)境，延長(zhǎng)生存期

 

主要結(jié)論

本文通過(guò)scRNA-seq和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)基因工程小鼠正常大腦和GBM兩個(gè)發(fā)展時(shí)期的樣本進(jìn)行分析，揭示了整個(gè)腫瘤過(guò)程中免疫細(xì)胞組成的大規(guī)模、全面的縱向變化。隨著GBM發(fā)展，發(fā)現(xiàn)GBM中存在一個(gè)高度增殖的小膠質(zhì)細(xì)胞群體，并且大部分細(xì)胞因子及其受體在免疫細(xì)胞中表達(dá)，很少來(lái)自EGFR+癌細(xì)胞；在晚期的腫瘤中發(fā)現(xiàn)了抗炎的巨噬細(xì)胞和致癌原細(xì)胞。髓源性抑制細(xì)胞，這種演變與血腦屏障的破壞和表皮生長(zhǎng)因子GBM+細(xì)胞的廣泛增長(zhǎng)相一致。IR/TMZ治療能夠通過(guò)促進(jìn)效應(yīng)CD8T細(xì)胞功能，提高生存期。本研究結(jié)果為GBM進(jìn)展過(guò)程中免疫和非免疫細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化提供了一個(gè)新的的視角，也為疾病的治療指明了新的方向。

 

參考文獻(xiàn)

Yeo, Alan T et al. “Single-cell RNA sequencing reveals evolution of immune landscape during glioblastoma progression.”Nature immunology vol. 23,6 (2022): 971-984. doi:10.1038/s41590-022-01215-0