單細(xì)胞多組學(xué)思路在研究腫瘤異質(zhì)性中的應(yīng)用

腎透明細(xì)胞癌（ccRCC）是腎細(xì)胞癌中最常見也最具侵襲性的癌癥亞型，容易術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。目前，ccRCC的治療方法主要包括常規(guī)化療、靶向治療和免疫治療，但療效受到腫瘤異質(zhì)性的影響。因此，有必要了解ccRCC的細(xì)胞和分子機(jī)制，以促進(jìn)biomarker的發(fā)現(xiàn)和指導(dǎo)臨床干預(yù)。

本文中，研究者利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，結(jié)合多組學(xué)聯(lián)合分析思路，繪制了ccRCC原發(fā)腫瘤組織的轉(zhuǎn)錄和表觀基因組圖譜，揭示了腫瘤特異的調(diào)控信號(hào)和免疫細(xì)胞功能相關(guān)的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（TFs），為剖析ccRCC的異質(zhì)性及鑒定潛在治療靶點(diǎn)提供了重要見解。

 

文章詳情

文章題目：Single-cell multiomics analysis reveals regulatory programs in clear cell renal cell carcinoma

中文題目：?jiǎn)渭?xì)胞多組學(xué)分析揭示腎透明細(xì)胞癌的調(diào)控程序

發(fā)表時(shí)間：2022.07

期刊名稱：Cell Discovery

影響因子：38.079

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：10x Chromium 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序+單細(xì)胞ATAC測(cè)序

DOI：10.1038/s41421-022-00415-0

 

研究?jī)?nèi)容

⏩ 單細(xì)胞水平分析ccRCC中的轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性

為了探究ccRCC腫瘤的異質(zhì)性，研究者對(duì)三名患者進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組+單細(xì)胞ATAC測(cè)序，并額外對(duì)一名患者進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（所有患者均攜帶VHL基因的突變）。經(jīng)過質(zhì)量控制篩選，共獲得38097個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和21272個(gè)細(xì)胞的染色質(zhì)可及性信息，并基于marker基因注釋到15種細(xì)胞類型。對(duì)于單細(xì)胞ATAC測(cè)序結(jié)果，基于marker基因啟動(dòng)子區(qū)域的可及性進(jìn)行細(xì)胞注釋，并將結(jié)果與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組結(jié)果比較和聯(lián)合分析，最終注釋到12種細(xì)胞類型。這12種細(xì)胞類型包括5種淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞（VCAM+和VCAM-）、系膜細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞（基于marker基因和infer CNV分析結(jié)果注釋得到）。在ccRCC整個(gè)腫瘤微環(huán)境（TME）中，免疫細(xì)胞占比最高，腫瘤細(xì)胞不到10%，且細(xì)胞豐度在不同患者內(nèi)有所不同。綜上所述，將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞ATAC測(cè)序結(jié)果整合分析揭示了ccRCC中細(xì)胞組成的異質(zhì)性。

Fig.1 人ccRCC單細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)可及性圖譜

 

⏩ ccRCC中的腫瘤特異性調(diào)控元件

對(duì)單細(xì)胞染色質(zhì)可及性進(jìn)行差異分析發(fā)現(xiàn)共有22682個(gè)獨(dú)特的peak在不同細(xì)胞類型具有顯著差異，并將其命名為DARs。大多數(shù) DARs 位于基因組的啟動(dòng)子和內(nèi)含子區(qū)域，并且其分布在不同細(xì)胞類型中相對(duì)保守。此外，研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的DARs和差異表達(dá)基因（DEGs）主要富集在代謝相關(guān)的生物學(xué)過程中。接下來，研究者利用算法篩選出在腫瘤細(xì)胞中富集的高特異性TFs，并鑒定出49個(gè)TFs在腫瘤細(xì)胞里的活性高于其他細(xì)胞類型。利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的ccRCC（TCGA-KIRC）隊(duì)列數(shù)據(jù)分析這些腫瘤特異性TFs與患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性TFs高表達(dá)的患者的總生存率和無病生存率更差。接下來，研究者從中挑選出四個(gè)表達(dá)水平與較差的總生存率顯著相關(guān)的TFs（HOXC5、VENTX、ISL1和OTP，它們的結(jié)合位點(diǎn)位于ATAC測(cè)序得到的染色質(zhì)可及區(qū)域里）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們調(diào)控多種腫瘤特異性基因，致使其在腫瘤中的表達(dá)水平顯著上升。而敲除這些TFs基因可顯著降低腫瘤細(xì)胞增殖并增加細(xì)胞死亡。為了尋找針對(duì)這些TFs的候選藥物，研究者使用了LINCS consortium找到了2個(gè)候選藥物能顯著降低HOXC5、VENTX和ISL1的表達(dá)水平，同時(shí)顯著降低了腫瘤細(xì)胞的增殖率。

Fig.2 鑒定腫瘤特異性調(diào)控元件

Fig.3 四種腫瘤特異性TFs的特性研究

 

⏩ ccRCC內(nèi)的惡性轉(zhuǎn)錄程序

研究者從四個(gè)樣品中選出3564個(gè)腫瘤細(xì)胞來分析ccRCC中基因表達(dá)模式在不同惡性細(xì)胞中是如何變化的，并發(fā)現(xiàn)在這些腫瘤細(xì)胞中持續(xù)存在多種不同的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。利用NMF法來定義了11個(gè)腫瘤內(nèi)轉(zhuǎn)錄程序，進(jìn)一步聚類分層確定了2個(gè)元程序，它們包含了四個(gè)樣品中高度相似的程序。利用通路富集分析來確認(rèn)這2個(gè)元程序的生物學(xué)功能發(fā)現(xiàn)元程序1的基因顯著富集于應(yīng)激相關(guān)途徑，而元程序2基因主要參與代謝相關(guān)的生物過程。再次結(jié)合TCGA-KIRC隊(duì)列數(shù)據(jù)檢驗(yàn)預(yù)后相關(guān)性發(fā)現(xiàn)元程序1高表達(dá)的患者總存活率較差，而元程序2高表達(dá)的患者總存活率較好。分析上文中鑒定到的四個(gè)腫瘤特異性TFs和這2個(gè)元程序的調(diào)控關(guān)系，發(fā)現(xiàn)元程序1中的VEGFA和元程序2的CRYAB都受到這四個(gè)TFs的調(diào)控。

Fig.4 解析ccRCC內(nèi)的惡性轉(zhuǎn)錄程序

 

⏩ ccRCC中CD8+T細(xì)胞聚類分析

CD8+T淋巴細(xì)胞在抑制腫瘤發(fā)展中起關(guān)鍵作用。為了闡明腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞的異質(zhì)性，研究者從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定到4個(gè)CD8+T細(xì)胞亞群，單細(xì)胞ATAC測(cè)序數(shù)據(jù)中鑒定到5個(gè)CD8+T細(xì)胞亞群。其中，耗竭亞群的細(xì)胞毒性、耗竭性和終末分化特性最強(qiáng)。組織駐留C1亞群的耗竭性祖細(xì)胞特征分?jǐn)?shù)最高，而終末耗竭特征分?jǐn)?shù)最低，說明這個(gè)亞群在腫瘤免疫治療中可能有重要作用。兩個(gè)組織駐留亞群中的C1與炎癥反應(yīng)顯著相關(guān)，而C2富集細(xì)胞因子和微生素代謝途徑。在TCGA-KIRC隊(duì)列和CheckMate-025（抗PD-1治療的隨機(jī)III期試驗(yàn)）隊(duì)列發(fā)現(xiàn)耗竭亞群中DEGs的平均表達(dá)水平與較差的總體生存率相關(guān)。與CD8+T細(xì)胞耗竭有關(guān)的調(diào)控元件：EOMES 和BATF，高度富集于耗竭亞群中，多個(gè)Rel/NF-κB 家族的 TFs也富集在耗竭亞群中。有趣的是，兩個(gè)耗竭即刻早期基因（IEG）細(xì)胞亞群受到不同TFs的調(diào)控。

Fig.5 ccRCC內(nèi)CD8+T細(xì)胞的特征

 

⏩ccRCC中巨噬細(xì)胞聚類分析

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是腫瘤中主要的髓細(xì)胞群，在腫瘤發(fā)生和耐藥性中起重要作用。為了闡明TAM的異質(zhì)性，研究者從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定到3個(gè)TAM細(xì)胞亞群，單細(xì)胞ATAC測(cè)序數(shù)據(jù)中鑒定到3個(gè)TAM細(xì)胞亞群。在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組得到的分群中，TAM-RGCC亞群的M1特征分?jǐn)?shù)最高，其次是TAM-C1QB亞群，而TAM-LGALS3的M2特征分?jǐn)?shù)最高。TAM-RGCC亞群具有較高的血管生成特征分?jǐn)?shù)，而TAM-C1QB亞群具有最高的吞噬作用特征分?jǐn)?shù)。此外，研究者確認(rèn)了免疫檢查點(diǎn)基因和共刺激分子的表達(dá)情況。影響T細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)的配體基因在TAM-C1QB亞群高度表達(dá)，而LGALS9在TAM-LGALS3特異性表達(dá)。研究者還發(fā)現(xiàn)三個(gè)TAM亞群具有不同的TF調(diào)控程序，其中有四個(gè)TFs的基因活性和表達(dá)水平在對(duì)應(yīng)的亞群中均大幅增加。其中MEF2C在促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞極化和誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡方面起到重要作用，該TF的靶基因包括多個(gè)TFs和趨化因子，這些靶基因已被證明與巨噬細(xì)胞的吞噬和血管生成作用相關(guān)。在TCGA-KIRC和CheckMate-025兩個(gè)隊(duì)列中，這些靶基因的特征分?jǐn)?shù)與更好的存活率有關(guān)。

Fig.6 ccRCC內(nèi)TAMs的特征

 

⏩ccRCC微環(huán)境中的細(xì)胞通訊

使用CellPhone DB分析ccRCC微環(huán)境中的細(xì)胞通訊，研究者發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞具有最多的配體受體互作關(guān)系對(duì)，而B細(xì)胞最少。腫瘤細(xì)胞是整個(gè)TME中關(guān)鍵的細(xì)胞類型，它們與其他細(xì)胞的互作關(guān)系在腫瘤發(fā)生過程中起重要作用。在本研究中，腫瘤細(xì)胞主要與內(nèi)皮細(xì)胞、TAMs、增殖性CD8+T細(xì)胞和耗竭T細(xì)胞相互作用。巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）及其配體互作是腫瘤細(xì)胞和TAM三個(gè)細(xì)胞亞群之間較強(qiáng)的相互作用。研究者還發(fā)現(xiàn)了在ccRCC中尚未報(bào)道的新互作關(guān)系，如RPS19和C5AR1（在乳腺癌和卵巢癌TME中起到免疫抑制作用）。在TCGA-KIRC隊(duì)列中，這兩個(gè)基因平均表達(dá)水平高的患者預(yù)后差。在腫瘤細(xì)胞與三種淋巴細(xì)胞亞群的互作關(guān)系中，研究者鑒定到Treg—腫瘤細(xì)胞特異性互作關(guān)系：LTB-LTBR，這是纖維肉瘤和肝細(xì)胞癌形成的必要因素。這兩個(gè)基因平均表達(dá)水平高也與較差的預(yù)后相關(guān)。

Fig.7 腫瘤和免疫細(xì)胞間的配體受體互作關(guān)系

 

結(jié)果總結(jié)

本研究利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞ATAC測(cè)序技術(shù)繪制了ccRCC的轉(zhuǎn)錄和表觀基因組圖譜，確定了四個(gè)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞特異性調(diào)控程序的關(guān)鍵TFs（HOXC5、VENTX、ISL1和OTP），它們具有預(yù)后意義。接下來，研究者聯(lián)合分析了CD8+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞亞群的染色質(zhì)可及性和基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)了這些細(xì)胞亞群中不同的調(diào)控元件。此外，研究者還描述了TME中配體-受體相互作用所介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊。綜上所述，這種單細(xì)胞多組學(xué)方法進(jìn)一步闡明了ccRCC的細(xì)胞異質(zhì)性，并確定潛在的治療靶點(diǎn)。