代謝組學(xué)助力發(fā)現(xiàn)羅氏菌屬與腸道褪黑素關(guān)聯(lián)以探究腸道疾病治療新策略

文章標(biāo)題：Roseburia hominis Increases Intestinal Melatonin Level by Activating p-CREB-AANAT Pathway
發(fā)表期刊：Nutrients
影響因子：6.706
作者單位：北京大學(xué)第三醫(yī)院
百趣生物提供服務(wù)：非靶標(biāo)代謝組學(xué)

一．研究背景
褪黑素可以維持晝夜節(jié)律并調(diào)節(jié)免疫功能，也分布在胃腸道，在局部發(fā)揮重要的抗氧化和抗炎功能，并調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)。然而，口服褪黑素會(huì)引起一些不良反應(yīng)，因此希望找到一種局部誘導(dǎo)褪黑素合成的方法，以避免當(dāng)其用于消化系統(tǒng)疾病治療時(shí)的不良影響或激素紊亂的風(fēng)險(xiǎn)。作者以前的研究結(jié)果表明，Roseburia hominis的豐度與結(jié)腸粘膜褪黑素的表達(dá)呈正相關(guān)，然而是否調(diào)節(jié)腸道褪黑素表達(dá)及其潛在機(jī)制尚不清楚。在本研究中，利用無(wú)菌大鼠和EC模型BON-1來(lái)確定Roseburia hominis與褪黑素之間的關(guān)系，以及涉及丙酸鹽、丁酸鹽、5-HT和磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（p-CREB）-AANAT途徑的具體機(jī)制。研究這些方面可能為IBS或炎癥性腸病提供新的治療策略。-百趣代謝組學(xué)解讀

二．材料和方法
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)一：使用R. hominis或磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）分別喂食大鼠，并在14天后使用腹部回撤反射評(píng)分評(píng)估其內(nèi)臟對(duì)直腸擴(kuò)張的敏感性，之后收集其腸n內(nèi)容物用于短鏈脂肪酸分析，血清用于褪黑素測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)二：給大鼠喂食丙酸鈉、丁酸鈉或相同體積的PBS，七天后收集腸組織用于IHC，Western。印跡、ELISA和qPCR，收集血清進(jìn)行褪黑素測(cè)定。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
使用和未使用色氨酸羥化酶抑制劑預(yù)處理的BON-1細(xì)胞，用細(xì)菌培養(yǎng)基，R. hominis上清液，PBS，丙酸鈉或丁酸鈉處理后提取總蛋白和上清液進(jìn)行進(jìn)一步分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
（1）R. hominis增加了大鼠腸和BON-1細(xì)胞中的褪黑素水平
百趣生物解讀，與對(duì)照組相比，口服R.hominis的大鼠，回腸和結(jié)腸粘膜中褪黑素陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量顯著增加（p<0.05，圖1B）。當(dāng)用20%和50%比例的R.hominis上清液處理BON-1細(xì)胞24小時(shí)后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞上清液中的褪黑素濃度顯著升高（p<0.05，圖1C）。此外，使用靶向代謝組學(xué)檢測(cè)到，R. hominis的施用還增加了盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物中丙酸鹽和丁酸鹽的濃度（p<0.05，圖1D）。
 

（3）丙酸鹽和丁酸鹽通過(guò)促進(jìn)5-HT的產(chǎn)生增加褪黑素水平
百趣代謝組學(xué)解讀，在丙酸鹽或丁酸鹽處理后測(cè)量5-HT水平。口服丙酸鈉或丁酸鈉的大鼠，回腸和結(jié)腸粘膜中5-HT陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量增加（p<0.05，圖3A,3B）。當(dāng)用丙酸鈉或丁酸鈉處理BON-1細(xì)胞24小時(shí)后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞裂解液中的5-HT濃度顯著升高（p<0.05，圖3C）。替洛司他是色氨酸羥化酶（TPH）的抑制劑，TPH是5-HT生物合成的限速酶，用替洛司他乙酯（1µM）預(yù)處理2小時(shí)可防止丙酸鹽或丁酸鹽給藥引起的5-HT水平升高（圖3C）。乙基替洛司他治療也抑制了褪黑素水平的增加（圖3D）。
 

（4）丙酸鹽和丁酸鹽通過(guò)p-CREB-AANAT途徑增加褪黑素水平
百趣解讀，口服丙酸鈉或丁酸鈉的大鼠，可顯著增加腸道組織中的AANAT水平（p<0.05，圖4A）。一致地，當(dāng)用丙酸鈉或丁酸鈉處理BON-1細(xì)胞24小時(shí)后，AANAT水平顯著增加（p<0.05，圖4B、C）。用Aanat的小干擾RNA（siRNA）預(yù)處理降低了BON-1細(xì)胞中的Aanat和褪黑素水平（p<0.05，圖4B、C）。此外，在體內(nèi)和體外，丙酸鹽和丁酸鹽處理后，Aanat mRNA水平顯著升高（p<0.05，圖4D、E）。
 

（5）丙酸鹽和丁酸鹽調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物和相關(guān)代謝途徑
百趣代謝組學(xué)解讀，PCA得分圖表明，與對(duì)照組相比，丁酸鹽處理顯著影響代謝譜[R2X（cum）=0.693]，而丙酸鹽組沒(méi)有有效地與對(duì)照組[R2X（cum）=0.73]分離（圖5A）。采用比主成分分析具有更好鑒別能力的OPLS-DA來(lái)基于類別信息表征代謝譜。OPLS-DA評(píng)分圖顯示了丙酸鹽組和對(duì)照組之間的明顯聚類[R2X（cum）=0.512，R2Y（cum）＝0.951，Q2（cum=0.252]，以及丁酸鹽組和控制組之間的聚類[R2X（cum）+0.477，R2Y（cum）-0.944，Q2（cum）=0.628]（圖5B）。

根據(jù)OPLS-DA模型的卡值（VIP）>1和p<0.05篩選差異代謝物。丙酸鹽組有43種，其中的31種上調(diào)，包括次黃嘌呤、丙酮酸、D-丙氨酸和吲哚。丁酸鹽組有40種，其中有10中上調(diào)，如丙酮酸、次黃嘌呤和肌苷。然后，基于BON-1細(xì)胞上清液中的差異代謝物進(jìn)行路徑富集和拓?fù)浞治�。與對(duì)照組相比，丙酸鹽組豐富了以下途徑，包括氨基酸代謝途徑，如“纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成”、“甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝”和“色氨酸代謝”；碳水化合物代謝途徑，如“檸檬酸循環(huán)”、“丙酮酸代謝”和“丁酸代謝”；核苷酸代謝途徑，如“嘌呤代謝”；以及其他氨基酸的代謝，如“�；撬岷偷团；撬岽�謝”（圖5C）。丁酸鹽組富含以下途徑：氨基酸代謝途徑，如“甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝”和“纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成”；碳水化合物代謝途徑，如“丁酸代謝”和“丙酮酸代謝”；以及其他氨基酸的代謝，如“�；撬岷偷团；撬岽�謝”（圖6C）。

分析了代謝產(chǎn)物水平與BON-1細(xì)胞上清液中褪黑素、AANAT、p-CREB和5-HT水平之間的關(guān)系。相關(guān)分析表明，各種代謝物的水平與褪黑素、AANAT、p-CREB和5-HT的水平顯著相關(guān)。具體而言，丙酮酸與褪黑素、AANAT、p-CREB和5-HT呈正相關(guān)；肌苷與褪黑素、AANAT和p-CREB呈正相關(guān)；次黃嘌呤和乙酰膽堿與褪黑素和AANAT正相關(guān)；吲哚與褪黑素呈正相關(guān)，表明這些代謝物可能促進(jìn)褪黑素合成（圖5D）。
 

討論
百趣代謝組學(xué)解讀，腸道褪黑素對(duì)胃腸道有多種作用。除了可能有效改善睡眠問(wèn)題和一些精神癥狀之外，當(dāng)用于IBS治療時(shí)，褪黑素的抗炎等作用顯示出改善腹痛和患者生活質(zhì)量的能力。然而，長(zhǎng)期外源性褪黑素治療可能會(huì)引起頭痛、皮疹和噩夢(mèng)等不良反應(yīng)。此外，以前的研究很少關(guān)注腸源性褪黑素對(duì)消化系統(tǒng)疾病的影響。

R.hominis是羅氏菌屬的代表種，羅氏菌屬豐度的改變可能影響多種代謝途徑，并與多種疾病相關(guān)，包括IBS、潰瘍性結(jié)腸炎、肥胖、2型糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和過(guò)敏。富含可發(fā)酵碳水化合物的飲食增加了羅氏菌屬的相對(duì)豐度，羅氏菌屬能夠降解多糖、低聚糖和糖，表明可發(fā)酵碳水化合物可能通過(guò)增加羅氏菌屬的豐度來(lái)提高腸道褪黑素。

本研究中表明丙酸鹽與丁酸鹽可能都在促進(jìn)褪黑素合成方面發(fā)揮類似作用。此外雖然相關(guān)研究較少，但二者具有一些獨(dú)特的健康促進(jìn)特性，如降低脂肪生成和血清膽固醇水平以及抗癌作用。

本研究表明丙酸鹽與丁酸鹽通過(guò)提高5-HT水平來(lái)調(diào)節(jié)褪黑素合成。其中丙酸鹽可能通過(guò)激活色氨酸代謝增加褪黑素合成，這需要進(jìn)一步驗(yàn)證。先前的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充�；撬犸@著提高了海馬中的p-CREB水平，改善了大鼠的抑郁行為，表明丙酸鹽和丁酸鹽可能激活p-CREB-AANAT信號(hào)，并通過(guò)增強(qiáng)�；撬岽�謝促進(jìn)褪黑素合成。此外，丁酸處理顯著增加了BON-1細(xì)胞上清液中的肌苷水平。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，肌苷注射顯著增加大鼠海馬和前額葉皮質(zhì)的p-CREB水平。相關(guān)性分析顯示肌苷水平與褪黑素、AANAT和p-CREB水平之間存在正相關(guān)，表明肌苷可能通過(guò)增加p-CRAB和AANAT水平促進(jìn)褪黑素合成，這需要進(jìn)一步研究（圖6：R.hominis在腸道褪黑素合成中的潛在機(jī)制）。
 

三．結(jié)論
總之，R.hominis通過(guò)其代謝產(chǎn)物丙酸鹽和丁酸鹽增加了腸道褪黑素的合成。潛在機(jī)制是丙酸鹽和丁酸鹽促進(jìn)5-HT合成并激活p-CREB-AANAT途徑。我們的研究提供了新的證據(jù)，證明微生物群干預(yù)可以通過(guò)增加腸道褪黑素水平，成為某些腸道疾�。ㄈ鏘BS和炎癥性腸�。┑臐撛谥委煵呗�。

文/阿趣代謝組學(xué)