細(xì)胞凍存與復(fù)蘇注意事項(xiàng)

細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮中，溫度達(dá)-196℃，理論上儲(chǔ)存時(shí)間是無限的。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。

在不加任何物質(zhì)的條件下，直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。若向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞。儲(chǔ)存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。

細(xì)胞凍存

細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的-5~0℃，細(xì)胞仍能生長，活力受損不大。目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油。

在細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇過程中，有如下事項(xiàng)需要注意。

1、不要在細(xì)胞狀態(tài)不好時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞凍存。如，長的太過了，培養(yǎng)液已經(jīng)很黃了；細(xì)胞可疑污染；細(xì)胞已經(jīng)開始凋亡或崩解；連續(xù)培養(yǎng)超過二個(gè)月，細(xì)胞性狀已有改變。應(yīng)該在增殖旺盛，情況穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)效果良好，復(fù)蘇后兩周內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞凍存。

2、凍存時(shí)細(xì)胞濃度低于1-5×106個(gè)/ml，很難復(fù)蘇成功，應(yīng)該離心后調(diào)整細(xì)胞濃度。

3、一定要選擇原配的管子和蓋子（不同牌子/型號(hào)的顏色會(huì)有差別），凍存管的蓋子一定要擰緊，否則復(fù)蘇水浴時(shí)會(huì)滲水，造成污染。

4、盡量選擇程序冷凍盒進(jìn)行細(xì)胞凍存。如果沒有，應(yīng)選擇厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。防止放在-80℃的凍存盒，壁太薄，細(xì)胞被迅速降溫。確保“緩降”。

5、凍存的細(xì)胞應(yīng)盡快轉(zhuǎn)入液氮，不要在-80℃冰箱放置超過一個(gè)月。

6、防止找不到或拿錯(cuò)細(xì)胞，每只凍存管都應(yīng)標(biāo)上細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間，并記錄在冊(cè)。

7、取細(xì)胞時(shí)應(yīng)做好防護(hù)措施，帶好防凍手套，護(hù)目鏡。細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。

8、必須在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化，復(fù)蘇溫度太慢，會(huì)造成細(xì)胞的損傷。如果凍存管的壁較厚，隔熱效果較好，可以適當(dāng)提高水浴溫度（37℃~40℃）。二甲亞砜（DMSO）最好選擇進(jìn)口產(chǎn)品。

9、提前預(yù)定超凈臺(tái)，減少復(fù)蘇后插在冰盒里等待的時(shí)間。復(fù)蘇后長時(shí)間（1h），還沒有加入新的培養(yǎng)液。高濃度DMSO防止胞內(nèi)形成冰晶，凍存時(shí)保護(hù)細(xì)胞，但復(fù)蘇溶解后，浸泡時(shí)間太久會(huì)對(duì)細(xì)胞有毒性。

10、關(guān)于細(xì)胞溶解后，是否需要離心的問題，需要根據(jù)特定的細(xì)胞情況而定。主要有兩種方式。一種是解凍后的細(xì)胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，第二天換液（后貼壁后即換液）。因?yàn)殡x心的目的是兩個(gè)，去除DMSO，去除死細(xì)胞，這個(gè)是標(biāo)準(zhǔn)流程。但對(duì)一般人來說，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間，轉(zhuǎn)的不夠活細(xì)胞沉底的少，細(xì)胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)過了活細(xì)胞會(huì)受壓過大，死亡。此外在操作過程中容易污染。另一種是須離心后，將凍存液倒干凈，且一定要倒干凈。

11、對(duì)于不離心直接加入培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法，培養(yǎng)基的加入量是個(gè)需要考慮的問題。主要涉及DMSO的濃度，如果你加入培養(yǎng)基太少，DMSO的濃度就會(huì)比較大，影響細(xì)胞生長。而加入培養(yǎng)基太多，又會(huì)影響細(xì)胞的貼壁效果。

12、DMSO的濃度在小于5%（也有說1%）的時(shí)候?qū)σ话慵?xì)胞沒有什么影響。所以如果你的凍存液的濃度是10%DMSO，那么1ml的細(xì)胞加入10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。

13、有些細(xì)胞復(fù)蘇后一星期才有起色，切忌要有耐心，不要換液，耐心等待，兩周后再做決定。不要復(fù)蘇三四天后，細(xì)胞沒有任何動(dòng)靜，認(rèn)為失敗，倒掉所有細(xì)胞。