代謝組學(xué)在研究“線粒體閃爍”揭示細(xì)胞“返老還童”的新奧秘中的應(yīng)用

發(fā)表期刊：Cell Metabolism

影響因子：22.415

發(fā)表時(shí)間：2018年

合作單位：中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院

今天BIOTREE百趣代謝組學(xué)將給大家分享阿趣生物協(xié)助客戶發(fā)表在Cell Metabolism上的一篇文章：Short-Term Mitochondrial Permeability Transition Pore Opening Modulates Histone Lysine Methylation at the Early Phase of Somatic Cell Reprogramming。

什么是“線粒體閃爍”?橫跨線粒體內(nèi)外膜的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）的瞬時(shí)開放稱為“線粒體閃爍”[1]。mPTP在細(xì)胞的生存和凋亡中起到了決定性的意義�？淄耆�開放會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，孔的瞬時(shí)開放會(huì)調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育。

百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，線粒體在多能干細(xì)胞（一種具有自我更新，自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞）的發(fā)育中起到重要作用，而體細(xì)胞再編程到誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞重構(gòu)染色質(zhì)的修飾，這一過程是否以及如何通過線粒體中的信號(hào)進(jìn)行調(diào)節(jié)還不得而知。

那么什么又是體細(xì)胞重編程呢？對(duì)一個(gè)分化成熟的細(xì)胞來說，其細(xì)胞核全能性的實(shí)現(xiàn)是建立在與卵細(xì)胞質(zhì)融合基礎(chǔ)上的。這種由體細(xì)胞向全能細(xì)胞的轉(zhuǎn)變稱為體細(xì)胞重編程[2]。大家熟知的克隆羊多莉就是這么“問世”的。

但現(xiàn)在要實(shí)現(xiàn)這一目的，體細(xì)胞核移植并不是唯一手段。2006年日本科學(xué)家山中伸彌(Shinya Yamanaka)首次利用病毒載體將四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的組合轉(zhuǎn)入分化的體細(xì)胞中，使其重編程而得到了類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞類型——誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，該成果在2012年被授予了諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

mPTP的開放及關(guān)閉對(duì)細(xì)胞的凋亡及發(fā)育產(chǎn)生的影響這背后是否以及是如何調(diào)控細(xì)胞核的還是未知的。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，基于以上結(jié)果，學(xué)者將研究的重心轉(zhuǎn)移至mPTP。研究發(fā)現(xiàn)在重編程的早期mPTP經(jīng)歷了短期開放，這種短暫的激活增強(qiáng)了重編程。短期mPTP的打開觸發(fā)線粒體ROS/miR-101c通路，增強(qiáng)PHF8（結(jié)構(gòu)同源植物域指蛋白）介導(dǎo)的多能性基因的H3K9me2/H3K27me3去甲基化，降低其在多能基因啟動(dòng)子區(qū)的占有率，提高重編程效率。

在重新編程的早期階段
mPTP的短期開放

為了確定mPTP在重編程過程中的狀態(tài)，對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)在Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc (SKOM)介導(dǎo)的重編程過程中的mPTP進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，研究發(fā)現(xiàn)mPTP的開放度在第3天增加，在第5天再次下降，并在第8天保持這個(gè)水平，鈣黃綠素?zé)晒馊緞�（Calcein）與mPTP開放程度呈負(fù)相關(guān)（圖A, B）。
 

注：A: 共聚焦圖像在重新編程的第0、3、5和8天分析mPTP的開放情況。樣品與calcein和CoCl2共載。B:  細(xì)胞相對(duì)殘留鈣黃綠素?zé)晒庠谥鼐幊踢^程中分別于第0、3、5、8天的定量情況。
 

早期的mPTP開放增強(qiáng)了重新編程

為了確定mPTP在重編程中起到的作用，研究人員區(qū)分了包含轉(zhuǎn)基因 Oct4 促進(jìn)因素驅(qū)動(dòng)綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)在內(nèi)的MEFs (小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)，根據(jù)鈣黃綠素?zé)晒獾膹?qiáng)度確定mPTP的放開。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，圖中可以看出高mPTP開放細(xì)胞的重編程效率高于低mPTP開放的效率（圖C）。
 

注：對(duì)高、低mPTP開放度的skom感染細(xì)胞進(jìn)行排序后，定量分析重組效率。

為了進(jìn)一步研究mPTP在重編程中的作用，研究人員通過增加或減少功能的方法來調(diào)節(jié)mPTP的打開。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，他們發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的mPTP組分親環(huán)素D（CypD）的過度表達(dá)導(dǎo)致mPTP打開，而CypD沉默抑制mPTP打開，這是一種線粒體基質(zhì)肽基脯氨酰順反式異構(gòu)酶，目前已知的可調(diào)節(jié)mPTP的開放(圖D)。
 

注：D: 在CypD過表達(dá)或沉默的條件下，用shRNA分析mPTP的開放情況。左圖為典型的共焦圖像，右圖為殘留鈣黃綠素?zé)晒獾亩�量�?/span>

CypD過表達(dá)H3K9me2和H3K27me3
的去甲基化依賴于PHF8

檢測(cè)了有或沒有CypD過表達(dá)的細(xì)胞重編程第3天組蛋白的甲基化狀態(tài)。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，在CypD過表達(dá)重編程的第3天和第4天，H3K9me2和H3K27me3的水平下降(圖E)，而其他測(cè)試組沒有顯示明顯的變化。通過H3K9me2和H3K27me3染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)分析其占用率，發(fā)現(xiàn)CypD過表達(dá)降低了其在Sox2、Nanog、Oct4等多能基因啟動(dòng)子區(qū)域的占用率。

因此，mPTP的激活導(dǎo)致H3K9me2和H3K27me3的整體去甲基化。H3K9和H3K27的甲基化受多種組蛋白去甲基化酶的調(diào)控，為了找出哪些組蛋白去甲基化酶參與了mPTP的開放。我們檢測(cè)了不同組蛋白去甲基化酶在有或無CypD過表達(dá)的細(xì)胞SKOM重編程過程中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在被檢測(cè)的蛋白中，只有PHF8在CypD過表達(dá)時(shí)增加(圖F)。此外，研究人員在重編程中使用shRNA對(duì)PHF8進(jìn)行沉默，發(fā)現(xiàn)敲除PHF8可以恢復(fù)H3K9me2和H3K27me3的水平，并通過CypD過表達(dá)削弱重編程效率的提高(圖G)。
 

注：E: 重組過程中CypD過表達(dá)第3天和第4天后H3K9me1/2/3和H3K27me1/2/3的Western blot分析。F: 重組后第3天和第4天CypD過表達(dá)細(xì)胞中PHF8的Western blot分析。G: H3K9me2和H3K27me3經(jīng)PHF8 shRNA處理和不經(jīng)PHF8 shRNA處理的CypD過表達(dá)細(xì)胞在重編程后第3天的Western blot分析。
 

靶標(biāo)代謝組學(xué)對(duì)α-KG進(jìn)行定量分析

PHF8催化賴氨酸去甲基化，需要a-酮戊二酸(a- KG)，這是三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)進(jìn)行定量測(cè)定代謝物水平，研究人員通過代謝物分析來定量重編程中CypD過表達(dá)后的a-KG水平。百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，CypD過表達(dá)細(xì)胞的a-KG水平高于對(duì)照組(圖H)。因此，a- KG的增加可能是PHF8活性增加的一個(gè)因素。
 

注：重組后第3天Flag和CypD過表達(dá)細(xì)胞中a-KG水平的高效液相色譜-質(zhì)譜分析

結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）在重編程的早期經(jīng)歷了短期開放，mPTP的開放使H3K9me2和H3K27me3發(fā)生去甲基化，導(dǎo)致它們?cè)诩?xì)胞中的多能性基因的啟動(dòng)子區(qū)域占有率降低。mPTP的開放增加了線粒體活性氧產(chǎn)物下游的PHF8蛋白水平和mir-101c，同時(shí)也提高了PHF8的輔因子a-酮戊二酸的水平。從而促進(jìn)體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉?xì)胞。

百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，研究結(jié)果表明，在mPTP介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控下，線粒體到核的新途徑?jīng)Q定了細(xì)胞的命運(yùn)。同時(shí)進(jìn)一步拉近了干細(xì)胞和臨床疾病治療的距離。而該方法與經(jīng)典的胚胎干細(xì)胞和體細(xì)胞核移植技術(shù)不同的是，它不使用胚胎細(xì)胞或卵細(xì)胞，所以沒有倫理學(xué)問題。雖然該方法的安全性還有待考量，但在發(fā)病機(jī)理以及疾病診斷等醫(yī)學(xué)方面都有巨大的潛力，值得未來深入地研究及學(xué)習(xí)。

參考文獻(xiàn)
[1]Ying Z , Chen K , Zheng L , et al. Transient Activation of Mitoflashes Modulates Nanog at the Early Phase of Somatic Cell Reprogramming[J]. Cell Metabolism, 2015, 23(1).

[2]安威．醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)（第三版）：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2013