基于雜交和分子標(biāo)簽的新型錯(cuò)誤矯正測(cè)序HYTEC-seq在臨床中的應(yīng)用

循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）分析已成為一種重要的臨床有用的癌癥診斷和治療監(jiān)測(cè)工具。然而，ctDNA檢測(cè)由于DNA濃度低，所以在技術(shù)上難度大且實(shí)驗(yàn)情況復(fù)雜。這篇文章中，科學(xué)家們描述了其在Ion Torrent 測(cè)序平臺(tái)上新開發(fā)的一種高靈敏度的ctDNA檢測(cè)方法，被稱之為基于雜交和標(biāo)簽技術(shù)的錯(cuò)誤校正測(cè)序（HYTEC-seq）。該方法結(jié)合了雜交捕獲和分子標(biāo)簽，以及新型variant caller PlasmaMutationDetector2以消除背景錯(cuò)誤�？蒲屑谊U述了使用已知突變的對(duì)照樣本用HYTEC-seq檢測(cè)未知突變時(shí)，分析靈敏度高。此外，為了證明這種方法在臨床中的實(shí)用性，科學(xué)家分析了44例晚期胰腺癌患者的血漿樣本，發(fā)現(xiàn)57%的患者存在突變，等位基因頻率低至0.23%。文章發(fā)表在NATURE scientific report期刊。

圖 1 （A）HYTEC-seq實(shí)驗(yàn)流程 （B）原始測(cè)序reads、單鏈一致序列（SSCSs）和HYTEC-seq測(cè)序的每個(gè)目標(biāo)位置的測(cè)序錯(cuò)誤（替換）的相對(duì)百分比 （C）三種方法的總體錯(cuò)誤率

實(shí)驗(yàn)方法
· 樣本制備和cfDNA提取
整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，科學(xué)家選取了四個(gè)細(xì)胞系和60個(gè)健康人的樣本，也檢測(cè)了44個(gè)病人的血漿樣本。實(shí)驗(yàn)采用50ng Multiplex I cfDNA Reference Standard Set（Horizon）作為標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證HYTEC seq的可靠性。將患者和對(duì)照組的外周血收集到EDTA管中，并進(jìn)行淋巴細(xì)胞梯度離心，將血漿在17000×g下離心10 min，去除細(xì)胞殘余和剩余血小板。采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen)從血漿中提取cfDNA。提取后的cfDNA儲(chǔ)存在-80℃待用。

· HYTEC seq 文庫(kù)設(shè)計(jì)和構(gòu)建
該文庫(kù)使用Y型接頭適用于Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)，帶有Ion Torrent 平臺(tái)的A和P1接頭序列，樣本條形碼序列，和用于錯(cuò)誤糾正的分子標(biāo)簽。具體操作如下:
· 將20µL兩種新型的100µM P1和A接頭寡核苷酸序列在50µL的反應(yīng)體積中分別退火
· 使用PCR儀將接頭寡核苷酸體系加熱到97.5°C，持續(xù)150s
· 關(guān)閉儀器，等待1小時(shí)讓接頭復(fù)性
· 將復(fù)性后的接頭根據(jù)cfDNA加入量用dd水稀釋待用

樣本DNA采取酶打斷法至160pb的片段，并使用磁珠進(jìn)行富集。片段長(zhǎng)度由安捷倫2100生物分析儀進(jìn)行質(zhì)控（High Sensitivity DNA kit）。文庫(kù)制備采用建庫(kù)試劑盒搭配安捷倫的靶向捕獲系統(tǒng)，采用了胰腺癌中常見突變的8個(gè)基因的靶向捕獲panel。捕獲到的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后由磁珠富集。最終文庫(kù)由安捷倫2100生物分析儀質(zhì)控。

在這篇測(cè)序方法開發(fā)的研究中，安捷倫2100生物分析儀又一次展現(xiàn)了其在核酸質(zhì)控領(lǐng)域的強(qiáng)勢(shì)地位�？蒲屑覀兪褂玫�2100生物分析儀主要原理芯片式毛細(xì)管電泳結(jié)合微流控技術(shù)，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度高。在本次研究中老師選擇的High Sensitivity DNA kit，擁有極高的 DNA 分析靈敏度，適用于低至 5 pg/µL 的片段分析，或低至 100 pg/µL 的 NGS 文庫(kù)等復(fù)雜 DNA 樣品分析。文中提到的其他試劑耗材以及安捷倫2100生物分析儀配套現(xiàn)貨試劑詳見下表，各位老師走過(guò)路過(guò)不要錯(cuò)過(guò)！