冷凍顯微鏡在制藥研究中推進藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)研究
作者：Linkam Scientific Instruments銷售及市場部經(jīng)理Clara Ko
在過去的二十年中，冷凍顯微鏡方法已經(jīng)成為生命科學(xué)家、制藥研究人員等廣泛使用的有效工具，用于檢查接近其原生狀態(tài)的生物結(jié)構(gòu)1。冷凍顯微鏡能夠可視化蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物等物質(zhì)的生物分子結(jié)構(gòu)，是對現(xiàn)有的方法如x射線晶體學(xué)和核磁共振(NMR)等的有價值的補充。確定蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)是藥物發(fā)現(xiàn)的一個重要部分，這對研究藥物靶點非常有意義，也是深入了解疾病機制的重要課題。
在這篇文章中，我們將闡述冷凍顯微鏡技術(shù)的使用，包括冷凍光學(xué)電子顯微鏡(cryo-CLEM)，冷凍干燥顯微鏡(FDM)，藥物研究中的低溫保存，以及溫度控制顯微鏡如何使研究人員能夠在低溫下推進藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)研究。
冷凍光學(xué)電子顯微鏡（Cryo-CLEM）
電子顯微鏡(EM)使用微量材料，具備接近原子的分辨率，可以研究不同功能狀態(tài)下的分子。冷凍電鏡（Cryo-EM）使用極低溫度，克服了真空條件下使用電子束測量高含水量生物標(biāo)本的難題。
在20世紀(jì)80年代冷凍電鏡商業(yè)化之前，生物標(biāo)本是通過化學(xué)固定或染色等方法制備的，但這些方法存在保存?zhèn)斡埃瑫绊憟D像分辨率。快速冷凍通常用于將樣品保持在與自然生理環(huán)境相似的冷凍狀態(tài)，在臨床前階段取得的結(jié)果必須在臨床研究中可復(fù)制，這在藥物研究中尤其重要。
Cryo-CLEM結(jié)合低溫?zé)晒饧夹g(shù)和冷凍電鏡技術(shù)，提高了活檢細(xì)胞內(nèi)生物、化學(xué)和遺傳過程的靈敏度。Cryo-CLEM能夠?qū)鋬龉潭悠分械姆肿踊蚍肿咏M件(如細(xì)胞內(nèi)膜、DNA或細(xì)胞結(jié)構(gòu)元件)進行直接熒光標(biāo)記和靶向，精確定位區(qū)域，以便后續(xù)使用EM進行高分辨率成像。
為了使生物樣品與EM中發(fā)現(xiàn)的真空條件兼容并保存結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，樣品被嵌入玻璃狀的冰中，需要保持在-140°C以下。必須避免與空氣中水分接觸，因為一旦接觸會形成冰晶并污染樣品。在低溫條件下，熒光信號的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)被保留，光漂白顯著減少。
冷凍光學(xué)電子顯微鏡技術(shù)的進步體現(xiàn)在它包含了創(chuàng)新的冷凍熒光級，如Linkam CMS196，它能夠自動獲取整個電鏡網(wǎng)格的高分辨率熒光圖。這也用于樣品導(dǎo)航，并將cryo-CLEM的案例情況與EM或與x射線顯微鏡等其他技術(shù)相關(guān)聯(lián)。
西班牙巴塞羅那的一組研究人員和臨床醫(yī)生使用熒光顯微鏡、透射電子顯微鏡(TEM)和低溫軟x射線斷層掃描(cryo-SXT)，可以觀察到抗癌藥物順鉑在極低濃度下的有效性，確定產(chǎn)生效果所需的最低劑量，以最大限度地降低毒性2。該小組在熒光顯微鏡上對低溫冷凍的細(xì)胞樣本進行成像，使用CMS196冷凍熒光臺在液氮溫度下將它們玻璃化，然后使用cryo-SXT對樣本進行分析，這使得在納米尺度上進行3D研究成為可能。
得益于現(xiàn)有的低溫成像技術(shù)，研究結(jié)果表明，三甲堿(研究的兩種佐劑之一)促進了順鉑在較低劑量下的有效治療，這可能為化療治療的發(fā)展鋪平了道路，減少了對患者的副作用。
凍干顯微鏡
許多藥物生產(chǎn)為凍干或凍干配方，以增加穩(wěn)定性和延長保質(zhì)期。藥物開發(fā)人員必須為新的藥物化合物創(chuàng)建一個優(yōu)化的冷凍干燥過程，這可能是一項復(fù)雜而昂貴的工作。為了簡化流程和開發(fā)更高效的冷凍干燥循環(huán)，了解三個主要冷凍干燥步驟的溫度和壓力要求是很重要的。使用冷凍干燥顯微鏡(FDM)，研究人員可以直接可視化每個步驟，并確定藥物產(chǎn)品在不同熱條件下的行為。
FDM包括一個專用的光學(xué)顯微鏡和一個專用的熱工作臺，它可以準(zhǔn)確地控制樣品的溫度和壓力，并允許實時進行熱測量。冷凍干燥的一個關(guān)鍵參數(shù)是塌陷溫度(Tc)，即產(chǎn)品失去結(jié)構(gòu)完整性并導(dǎo)致加工缺陷的溫度。FDM使藥物開發(fā)人員能夠密切監(jiān)測樣品并快速有效地調(diào)整冷凍干燥方案。
英國國家生物標(biāo)準(zhǔn)與控制研究所(NIBSC)的一個研究小組正在利用先進的FDM技術(shù)研究冷凍干燥藥物的復(fù)雜性。該小組由Paul Matejtschuk博士領(lǐng)導(dǎo)，正專注于研究優(yōu)化凍干脂質(zhì)體藥物的配方。由于凍干脂質(zhì)體藥物物理和化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，這對開發(fā)提出了挑戰(zhàn)。Matejtschuk博士和他的團隊使用安裝在光學(xué)顯微鏡上的專用冷凍臺(FDCS196, Linkam科學(xué)儀器)(圖1)，通過估計凍結(jié)、塌陷和融化溫度，預(yù)測脂質(zhì)體-冷凍保護劑混合物的理想的冷凍干燥條件3。
在過去的二十年中，冷凍顯微鏡方法已經(jīng)成為生命科學(xué)家、制藥研究人員等廣泛使用的有效工具，用于檢查接近其原生狀態(tài)的生物結(jié)構(gòu)1。冷凍顯微鏡能夠可視化蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物等物質(zhì)的生物分子結(jié)構(gòu)，是對現(xiàn)有的方法如x射線晶體學(xué)和核磁共振(NMR)等的有價值的補充。確定蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)是藥物發(fā)現(xiàn)的一個重要部分，這對研究藥物靶點非常有意義，也是深入了解疾病機制的重要課題。
在這篇文章中，我們將闡述冷凍顯微鏡技術(shù)的使用，包括冷凍光學(xué)電子顯微鏡(cryo-CLEM)，冷凍干燥顯微鏡(FDM)，藥物研究中的低溫保存，以及溫度控制顯微鏡如何使研究人員能夠在低溫下推進藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)研究。
冷凍光學(xué)電子顯微鏡（Cryo-CLEM）
電子顯微鏡(EM)使用微量材料，具備接近原子的分辨率，可以研究不同功能狀態(tài)下的分子。冷凍電鏡（Cryo-EM）使用極低溫度，克服了真空條件下使用電子束測量高含水量生物標(biāo)本的難題。
在20世紀(jì)80年代冷凍電鏡商業(yè)化之前，生物標(biāo)本是通過化學(xué)固定或染色等方法制備的，但這些方法存在保存?zhèn)斡埃瑫绊憟D像分辨率。快速冷凍通常用于將樣品保持在與自然生理環(huán)境相似的冷凍狀態(tài)，在臨床前階段取得的結(jié)果必須在臨床研究中可復(fù)制，這在藥物研究中尤其重要。
Cryo-CLEM結(jié)合低溫?zé)晒饧夹g(shù)和冷凍電鏡技術(shù)，提高了活檢細(xì)胞內(nèi)生物、化學(xué)和遺傳過程的靈敏度。Cryo-CLEM能夠?qū)鋬龉潭悠分械姆肿踊蚍肿咏M件(如細(xì)胞內(nèi)膜、DNA或細(xì)胞結(jié)構(gòu)元件)進行直接熒光標(biāo)記和靶向，精確定位區(qū)域，以便后續(xù)使用EM進行高分辨率成像。
為了使生物樣品與EM中發(fā)現(xiàn)的真空條件兼容并保存結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，樣品被嵌入玻璃狀的冰中，需要保持在-140°C以下。必須避免與空氣中水分接觸，因為一旦接觸會形成冰晶并污染樣品。在低溫條件下，熒光信號的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)被保留，光漂白顯著減少。
冷凍光學(xué)電子顯微鏡技術(shù)的進步體現(xiàn)在它包含了創(chuàng)新的冷凍熒光級，如Linkam CMS196，它能夠自動獲取整個電鏡網(wǎng)格的高分辨率熒光圖。這也用于樣品導(dǎo)航，并將cryo-CLEM的案例情況與EM或與x射線顯微鏡等其他技術(shù)相關(guān)聯(lián)。
西班牙巴塞羅那的一組研究人員和臨床醫(yī)生使用熒光顯微鏡、透射電子顯微鏡(TEM)和低溫軟x射線斷層掃描(cryo-SXT)，可以觀察到抗癌藥物順鉑在極低濃度下的有效性，確定產(chǎn)生效果所需的最低劑量，以最大限度地降低毒性2。該小組在熒光顯微鏡上對低溫冷凍的細(xì)胞樣本進行成像，使用CMS196冷凍熒光臺在液氮溫度下將它們玻璃化，然后使用cryo-SXT對樣本進行分析，這使得在納米尺度上進行3D研究成為可能。
得益于現(xiàn)有的低溫成像技術(shù)，研究結(jié)果表明，三甲堿(研究的兩種佐劑之一)促進了順鉑在較低劑量下的有效治療，這可能為化療治療的發(fā)展鋪平了道路，減少了對患者的副作用。
凍干顯微鏡
許多藥物生產(chǎn)為凍干或凍干配方，以增加穩(wěn)定性和延長保質(zhì)期。藥物開發(fā)人員必須為新的藥物化合物創(chuàng)建一個優(yōu)化的冷凍干燥過程，這可能是一項復(fù)雜而昂貴的工作。為了簡化流程和開發(fā)更高效的冷凍干燥循環(huán)，了解三個主要冷凍干燥步驟的溫度和壓力要求是很重要的。使用冷凍干燥顯微鏡(FDM)，研究人員可以直接可視化每個步驟，并確定藥物產(chǎn)品在不同熱條件下的行為。
FDM包括一個專用的光學(xué)顯微鏡和一個專用的熱工作臺，它可以準(zhǔn)確地控制樣品的溫度和壓力，并允許實時進行熱測量。冷凍干燥的一個關(guān)鍵參數(shù)是塌陷溫度(Tc)，即產(chǎn)品失去結(jié)構(gòu)完整性并導(dǎo)致加工缺陷的溫度。FDM使藥物開發(fā)人員能夠密切監(jiān)測樣品并快速有效地調(diào)整冷凍干燥方案。
英國國家生物標(biāo)準(zhǔn)與控制研究所(NIBSC)的一個研究小組正在利用先進的FDM技術(shù)研究冷凍干燥藥物的復(fù)雜性。該小組由Paul Matejtschuk博士領(lǐng)導(dǎo)，正專注于研究優(yōu)化凍干脂質(zhì)體藥物的配方。由于凍干脂質(zhì)體藥物物理和化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，這對開發(fā)提出了挑戰(zhàn)。Matejtschuk博士和他的團隊使用安裝在光學(xué)顯微鏡上的專用冷凍臺(FDCS196, Linkam科學(xué)儀器)(圖1)，通過估計凍結(jié)、塌陷和融化溫度，預(yù)測脂質(zhì)體-冷凍保護劑混合物的理想的冷凍干燥條件3。
圖1:NIBSC實驗室的儀器配置。Linkam FDCS196冷凍干燥冷凍臺，T94控制器和液氮泵，真空泵，奧林巴斯BX51光學(xué)顯微鏡。圖像顯示FDM系統(tǒng)的舊版本
圖2: Linkam FDCS196凍干顯微鏡系統(tǒng)的最新版本。
這樣的實驗對于繼續(xù)努力開發(fā)快速、可轉(zhuǎn)移和可擴展的冷凍干燥方法來穩(wěn)定脂質(zhì)體等藥物化合物至關(guān)重要。
低溫貯藏
儲存用于研究的生物標(biāo)本有賴于有效的保存技術(shù)，以保持細(xì)胞的物理和生物完整性。冷凍或冷凍樣品可能會導(dǎo)致冰晶的積聚，導(dǎo)致終端細(xì)胞損傷。冷凍保護劑是在冷凍過程中通過降低水的熔點來防止細(xì)胞損傷的重要物質(zhì)。許多生物，如極地昆蟲、魚類和兩棲動物，會產(chǎn)生自己的冷凍保護劑或防凍化合物�？茖W(xué)家們正在研究這些化合物，以開發(fā)新的冷凍保護劑來保存研究用的細(xì)胞。
例如，由Matthew Gibson博士領(lǐng)導(dǎo)的英國華威大學(xué)的研究人員，正在研究防凍劑(糖)蛋白(AFP)，目的是開發(fā)新的合成AFP模擬化合物。該實驗室使用低溫生物學(xué)工作臺(BCS196，Linkam Scientific Instruments)來測量細(xì)胞中的冰晶生長，依靠該儀器的溫度控制能力來觀察AFP。Gibson博士研究了使用金納米顆粒作為探針來測量冰再結(jié)晶抑制活性現(xiàn)象，使用低溫生物學(xué)工作臺來改變溫度，并開發(fā)出一種高通量方法來篩選類似AFP具有結(jié)構(gòu)特征的材料。4
諸如此類的發(fā)現(xiàn)為開發(fā)新型冷凍保護劑提供了潛力，這種保護劑可以防止冷凍保存細(xì)胞中冰的生長，從而保持細(xì)胞的完整性，因此在生物醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究中具有潛在用途。
未來藥物研究
本文中描述的技術(shù)強調(diào)了目前已有的各種冷凍顯微鏡方法的選擇，這些方法有助于推進藥物研究。Cryo-CLEM結(jié)合了cryo-EM和低溫?zé)晒獾牧α浚鳛橐环N相對較新的技術(shù)，它的成功依賴于專用冷凍工作臺的發(fā)展，從而促進了Cryo-CLEM工作流程。這種工作臺能夠在液氮溫度下保持玻璃化樣品，使它們在從熒光顯微鏡移動到冷凍電鏡成像時保持無污染。其他專用的冷凍臺可與廣泛的顯微鏡技術(shù)兼容，如FDM，可在成像過程中精確控制樣品的溫度，低至-196°C。這些創(chuàng)新為制藥研究人員新療法和生產(chǎn)工藝評估，以及生物樣本保存以供未來研究等大量應(yīng)用提供了工具。
有關(guān)溫控顯微鏡臺的更多信息，請訪問https://www.linkam.co.uk/cryobiology
參考文獻：
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3. effectiveness of cisplatin on cutaneous squamous carcinoma cells using two different types of adjuvants. PLoS ONE. 2020; 15(3): e0230022.
4. Hussain M.T., Forbes N., Perrie Y., Malik K.P., Duru C. and Matejtschuk P. Freeze-drying cycle optimization for the rapid preservation of protein-loaded liposomal formulations. International Journal of Pharmaceutics 573, 2020; 118722.
5. Mitchell, D. E., Congdon, T., Rodger, A., and Gibson, M. I. Gold Nanoparticle Aggregation as a Probe of Antifreeze (Glyco) Protein-Inspired Ice Recrystallization Inhibition and Identification of New IRI Active Macromolecules. Scientific Reports, 2015; 5: 15716.
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