動物細胞融合實驗操作簡要流程
定義：
動物細胞融合是指兩個或者多個動物細胞結合形成一個細胞的過程。融合后形成具有原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞，稱為雜交瘤細胞。
動物細胞融合通常有物理法（電刺激）、化學法（聚乙二醇）、生物法（滅活病毒）三種方法。而雜交瘤細胞是由經免疫的B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合而成的，既有無限增殖能力又能產生特定抗體能力的細胞。
實驗材料：
DMEM高糖培養(yǎng)基
FBS/NBS
生物安全柜
滅菌手術剪刀、鑷子
HAT或HT選擇培養(yǎng)基
CO2細胞培養(yǎng)箱
雙抗（青鏈霉素混合液）
5mL一次性無菌注射器
單通道移液槍、多通道移液槍
低速離心機
倒置相差顯微鏡
96孔細胞培養(yǎng)板[NEST]
100mm細胞培養(yǎng)皿[NEST]
200μL、1000μL吸頭[NEST]
220目（70μm）細胞篩[NEST]
實驗準備：
飼養(yǎng)細胞：
融合前一天，取符合免疫質控標準的Balb/c小鼠，脫頸處死并泡在75%酒精中消毒。
用手術剪刀輕輕剪開老鼠的腹部皮膚。（注意請勿破壞小鼠的腹膜）取10mL DMEM培養(yǎng)基在50mL無菌離心管中， 5mL注射器吸取3~5mL培養(yǎng)基，用手術鑷子提起小鼠腹膜，將5ml培養(yǎng)基打入老鼠腹部，反復吹打3-4次后將培養(yǎng)基回收，置于50ml無菌離心管中。再次吸取5ml培養(yǎng)基，重復此步驟。在無菌條件下取出小鼠脾臟，用研磨器研磨脾臟，與DMEM混合過篩網制成單個脾細胞懸液，再與腹腔細胞懸液混合，低速離心（1000rpm*10min），棄上清。使用HAT培養(yǎng)基重懸，制成飼養(yǎng)細胞懸液，可按照105/孔使用，均勻鋪96孔板，每孔100μL。（在制備過程中嚴格保證無菌）SP2/0準備：
SP2/0細胞在融合前4—5天復蘇，培養(yǎng)換液，使細胞在融合前狀態(tài)良好且處于對數增長期。
試劑準備：
取1mL/管50% PEG1450一支，DMEM，FBS-DMEM，FBS-DMEM(HAT)等試劑，均預熱置37℃
實驗流程：
SP2/0收集：
SP2/0低速離心（1000rpm*5min），棄上清，用DMEM復懸清洗，再重復一次此步驟，37℃復懸備用。
脾細胞懸液制備：
取免疫完成的小鼠，眼球取血后，浸潤在75%的酒精中消毒滅菌。在無菌條件下取出其脾臟，使用研磨器研磨脾臟，與DMEM混合過篩網制成單個脾細胞懸液，低速離心（1000rpm*10min），棄上清，用DMEM清洗并再一次重復此步驟，37℃復懸備用。
細胞融合：
將脾細胞和SP2/0按照[脾細胞：SP2/0 = 2:1~3:1]的比例，混合于50ml離心管中低速離心（1000rpm*10min），棄上清且確保管內無液體殘留，將細胞團塊輕輕敲散，使脾細胞 & SP2/0在管底均勻混合鋪開。加入預熱完成的50% PEG1450 ，在1min內逐滴均勻加入，加完后37℃反應1min，反應完成后加入10~15ml左右終止液（DMEM）終止反應，由慢至快逐步滴加，10min全部加入完成。
融合鋪板：
細胞融合完成后，低速離心（1000rpm*10min），棄上清，使用FBS-DMEM(HAT)復懸細胞制成細胞懸液，（過程中注意動作輕柔，不可用力吹打，以免破壞融合細胞降低融合率）。將提前一天已加入飼養(yǎng)細胞的細胞培養(yǎng)板取出，用吸頭將板內培養(yǎng)基上清全部吸出丟棄，將剛制備完成的細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL，轉入5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。
融合換液：
融合細胞在FBS-DMEM(HAT)中培養(yǎng)3~7天，根據細胞融合情況，將培養(yǎng)上清吸出丟棄，更換成FBS-DMEM(HT)，每孔200μL。換液后觀察細胞形態(tài)，根據細胞生長情況，在4~7天后用Elisa進行融合陽性篩選檢測。
附：可使用到的耐思產品
細胞培養(yǎng)板
移液吸頭
微量離心管
細胞培養(yǎng)皿
細胞篩
