小鼠單克隆抗體雜交瘤細胞定株簡要流程
實驗材料：
DMEM高糖培養(yǎng)基 FBS/NBS
HT選擇培養(yǎng)基 CO2細胞培養(yǎng)箱
細胞計數(shù)器 單通道移液槍、多通道移液槍
相差顯微鏡 生物安全柜
10μL、200μL、1000μL吸頭 [NEST]
96/24/6孔細胞培養(yǎng)板 [NEST]
15mL、50mL無菌離心管 [NEST]
100mm細胞培養(yǎng)皿 [NEST]
T75細胞培養(yǎng)瓶 [NEST]
96孔酶標板 [NEST]
實驗準備：
陽性對照：
融合前采對應(yīng)實驗的小鼠眼球血，37℃放置2h，然后4℃放置2h，最后10000rpm離心10min，取上清，-20℃條件下保存。（使用前提前解凍，稀釋1000倍備用）
陰性對照：
各個階段培養(yǎng)基留5ml左右，作為陰性對照用。
Elisa檢測板準備：
將對應(yīng)抗原用CB以1μg/ml濃度加入96孔酶標板內(nèi)（100μl/孔），4℃過夜靜置包被。用1×PBST洗板2遍，清洗結(jié)束，加入封閉液封閉，37℃封閉1h，用1×PBST洗板2遍，拍干水分，4℃短期保存，-20℃長期保存。
實驗流程
融合檢測：
細胞融合換液后，等4~7天，觀察細胞融合狀態(tài)，大部分細胞培養(yǎng)孔內(nèi)出現(xiàn)小細胞團，即可開始檢測。
用排槍取融合培養(yǎng)上清100μL/孔至包被好的Elisa檢測板中，因為Elisa檢測板來源于外部，切記從細胞培養(yǎng)板中單次取液，不可反復(fù)吸取，取一次液換一次槍頭，防止污染細胞培養(yǎng)板內(nèi)細胞，以及交叉污染影響檢測結(jié)果。（每塊板預(yù)留一孔陽性對照孔，一孔陰性培養(yǎng)基對照孔）
根據(jù)陰性對照和陽性對照的OD值，確定陽性孔，取陽性對照OD值得一半以上的數(shù)值為陽性。
第一次亞克�。�
根據(jù)融合檢測的數(shù)據(jù)，挑選陽性孔，將陽性孔中的細胞轉(zhuǎn)移至24孔板中培養(yǎng)擴增，根據(jù)細胞生長情況2~3天后采用Elisa方法復(fù)檢，防止假陽性。
挑選24孔板中復(fù)檢陽性的孔，進行細胞復(fù)懸，使細胞在培養(yǎng)基中分散均勻。用細胞計數(shù)板進行計數(shù)，計數(shù)完成后，根據(jù)計數(shù)情況比例稀釋細胞懸液，按照1個/孔的密度均勻鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中，一個陽性克隆株鋪一塊細胞培養(yǎng)板板。[一次亞克隆采用FBS-DMEM(HT),培養(yǎng)基的血清使用濃度略低于融合時的濃度，略高于SP2/0常規(guī)培養(yǎng)濃度，可按照5% 進行區(qū)分]
畫克�。�
一次亞克隆后，融合細胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~5天后，采用相差顯微鏡逐孔觀察，在單孔內(nèi)有且只有一個正圓形細胞團的孔，即為單克隆細胞孔，做好標記。若無無單克隆孔，則挑選細胞團較少的多克隆細胞孔，做好標記。
一次亞克隆檢測：
畫克隆后，繼續(xù)培養(yǎng)3~5天，根據(jù)細胞生長情況，采用Elisa法進行一次亞克隆檢測，優(yōu)選挑選陽性單克隆孔，若無陽性單克隆孔，則挑選克隆數(shù)較少的陽性多克隆孔。挑選出來的細胞株轉(zhuǎn)移至24孔擴增培養(yǎng)，進行陽性克隆株復(fù)篩，確保挑選的細胞株非假陽性。
二次亞克隆：
將一次亞克隆挑選出來的細胞株，重復(fù)一次亞克隆步驟。細胞培養(yǎng)基換成FBS-DMEM，培養(yǎng)基的血清使用濃度調(diào)整成SP2/0的常規(guī)培養(yǎng)濃度。
畫克隆
二次亞克隆后4~5天，進行畫克隆，單克隆孔做好標記。
二次亞克隆檢測：
畫克隆后，繼續(xù)培養(yǎng)3~5天，重復(fù)一次亞克隆檢測步驟，挑選陽性單克隆細胞株，準備進行擴增培養(yǎng)。
建株：
陽性單克隆細胞株需進行至少2次的亞克隆，檢測為全陽方可建株！若為了保證穩(wěn)定性，建議進行第三次亞克隆。
挑出兩次檢測均為單克隆且全為陽性后，在24孔板中培養(yǎng)擴增，2~3天后用Elisa法進行交叉檢測（主要針對帶標簽的蛋白抗原）和穩(wěn)定性鑒定。
檢測合格后挑選一個細胞狀態(tài)，長勢較好且陽性O(shè)D值較高的細胞株，轉(zhuǎn)移至6孔板進行培養(yǎng)擴增，2~3天后，用亞型檢測試劑盒進行抗體亞型鑒定。
完成以上鑒定后，將單克隆細胞株轉(zhuǎn)移至100m細胞培養(yǎng)皿或者T75細胞培養(yǎng)瓶中進行大量擴增。
擴增完成后將單克隆細胞株進行細胞凍存，標記好細胞名稱、凍存者、凍存日期等信息，放置凍存盒中，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱，一天后轉(zhuǎn)移至液氮罐中儲存。
凍存后一周再復(fù)蘇檢測，防止細胞株出現(xiàn)產(chǎn)抗不穩(wěn)定現(xiàn)象，若檢測沒有問題，則將細胞株錄入細胞庫中，并撰寫實驗報告。（細胞凍存3支/株，且3支確保有2個及以上凍存批次，避免出現(xiàn)凍存失誤，細胞株丟失）
使用到的NEST產(chǎn)品：
10μL、200μL、1000μL吸頭 [NEST]
96/24/6孔細胞培養(yǎng)板 [NEST]
15mL、50mL無菌離心管 [NEST]
100mm細胞培養(yǎng)皿 [NEST]
T75細胞培養(yǎng)瓶 [NEST]
96孔酶標板 [NEST]
DMEM高糖培養(yǎng)基 FBS/NBS
HT選擇培養(yǎng)基 CO2細胞培養(yǎng)箱
細胞計數(shù)器 單通道移液槍、多通道移液槍
相差顯微鏡 生物安全柜
10μL、200μL、1000μL吸頭 [NEST]
96/24/6孔細胞培養(yǎng)板 [NEST]
15mL、50mL無菌離心管 [NEST]
100mm細胞培養(yǎng)皿 [NEST]
T75細胞培養(yǎng)瓶 [NEST]
96孔酶標板 [NEST]
實驗準備：
陽性對照：
融合前采對應(yīng)實驗的小鼠眼球血，37℃放置2h，然后4℃放置2h，最后10000rpm離心10min，取上清，-20℃條件下保存。（使用前提前解凍，稀釋1000倍備用）
陰性對照：
各個階段培養(yǎng)基留5ml左右，作為陰性對照用。
Elisa檢測板準備：
將對應(yīng)抗原用CB以1μg/ml濃度加入96孔酶標板內(nèi)（100μl/孔），4℃過夜靜置包被。用1×PBST洗板2遍，清洗結(jié)束，加入封閉液封閉，37℃封閉1h，用1×PBST洗板2遍，拍干水分，4℃短期保存，-20℃長期保存。
實驗流程
融合檢測：
細胞融合換液后，等4~7天，觀察細胞融合狀態(tài)，大部分細胞培養(yǎng)孔內(nèi)出現(xiàn)小細胞團，即可開始檢測。
用排槍取融合培養(yǎng)上清100μL/孔至包被好的Elisa檢測板中，因為Elisa檢測板來源于外部，切記從細胞培養(yǎng)板中單次取液，不可反復(fù)吸取，取一次液換一次槍頭，防止污染細胞培養(yǎng)板內(nèi)細胞，以及交叉污染影響檢測結(jié)果。（每塊板預(yù)留一孔陽性對照孔，一孔陰性培養(yǎng)基對照孔）
根據(jù)陰性對照和陽性對照的OD值，確定陽性孔，取陽性對照OD值得一半以上的數(shù)值為陽性。
第一次亞克�。�
根據(jù)融合檢測的數(shù)據(jù)，挑選陽性孔，將陽性孔中的細胞轉(zhuǎn)移至24孔板中培養(yǎng)擴增，根據(jù)細胞生長情況2~3天后采用Elisa方法復(fù)檢，防止假陽性。
挑選24孔板中復(fù)檢陽性的孔，進行細胞復(fù)懸，使細胞在培養(yǎng)基中分散均勻。用細胞計數(shù)板進行計數(shù)，計數(shù)完成后，根據(jù)計數(shù)情況比例稀釋細胞懸液，按照1個/孔的密度均勻鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中，一個陽性克隆株鋪一塊細胞培養(yǎng)板板。[一次亞克隆采用FBS-DMEM(HT),培養(yǎng)基的血清使用濃度略低于融合時的濃度，略高于SP2/0常規(guī)培養(yǎng)濃度，可按照5% 進行區(qū)分]
畫克�。�
一次亞克隆后，融合細胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~5天后，采用相差顯微鏡逐孔觀察，在單孔內(nèi)有且只有一個正圓形細胞團的孔，即為單克隆細胞孔，做好標記。若無無單克隆孔，則挑選細胞團較少的多克隆細胞孔，做好標記。
一次亞克隆檢測：
畫克隆后，繼續(xù)培養(yǎng)3~5天，根據(jù)細胞生長情況，采用Elisa法進行一次亞克隆檢測，優(yōu)選挑選陽性單克隆孔，若無陽性單克隆孔，則挑選克隆數(shù)較少的陽性多克隆孔。挑選出來的細胞株轉(zhuǎn)移至24孔擴增培養(yǎng)，進行陽性克隆株復(fù)篩，確保挑選的細胞株非假陽性。
二次亞克隆：
將一次亞克隆挑選出來的細胞株，重復(fù)一次亞克隆步驟。細胞培養(yǎng)基換成FBS-DMEM，培養(yǎng)基的血清使用濃度調(diào)整成SP2/0的常規(guī)培養(yǎng)濃度。
畫克隆
二次亞克隆后4~5天，進行畫克隆，單克隆孔做好標記。
二次亞克隆檢測：
畫克隆后，繼續(xù)培養(yǎng)3~5天，重復(fù)一次亞克隆檢測步驟，挑選陽性單克隆細胞株，準備進行擴增培養(yǎng)。
建株：
陽性單克隆細胞株需進行至少2次的亞克隆，檢測為全陽方可建株！若為了保證穩(wěn)定性，建議進行第三次亞克隆。
挑出兩次檢測均為單克隆且全為陽性后，在24孔板中培養(yǎng)擴增，2~3天后用Elisa法進行交叉檢測（主要針對帶標簽的蛋白抗原）和穩(wěn)定性鑒定。
檢測合格后挑選一個細胞狀態(tài)，長勢較好且陽性O(shè)D值較高的細胞株，轉(zhuǎn)移至6孔板進行培養(yǎng)擴增，2~3天后，用亞型檢測試劑盒進行抗體亞型鑒定。
完成以上鑒定后，將單克隆細胞株轉(zhuǎn)移至100m細胞培養(yǎng)皿或者T75細胞培養(yǎng)瓶中進行大量擴增。
擴增完成后將單克隆細胞株進行細胞凍存，標記好細胞名稱、凍存者、凍存日期等信息，放置凍存盒中，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱，一天后轉(zhuǎn)移至液氮罐中儲存。
凍存后一周再復(fù)蘇檢測，防止細胞株出現(xiàn)產(chǎn)抗不穩(wěn)定現(xiàn)象，若檢測沒有問題，則將細胞株錄入細胞庫中，并撰寫實驗報告。（細胞凍存3支/株，且3支確保有2個及以上凍存批次，避免出現(xiàn)凍存失誤，細胞株丟失）
使用到的NEST產(chǎn)品：
10μL、200μL、1000μL吸頭 [NEST]
96/24/6孔細胞培養(yǎng)板 [NEST]
15mL、50mL無菌離心管 [NEST]
100mm細胞培養(yǎng)皿 [NEST]
T75細胞培養(yǎng)瓶 [NEST]
96孔酶標板 [NEST]
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