動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)操作簡要流程

定義：

動(dòng)物細(xì)胞融合是指兩個(gè)或者多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的過程。融合后形成具有原來兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞，稱為雜交瘤細(xì)胞。

DMEM高糖培養(yǎng)基 
FBS/NBS
生物安全柜
滅菌手術(shù)剪刀、鑷子
HAT或HT選擇培養(yǎng)基 
CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱
雙抗（青鏈霉素混合液） 
5mL一次性無菌注射器
單通道移液槍、多通道移液槍
低速離心機(jī)
倒置相差顯微鏡

飼養(yǎng)細(xì)胞：

融合前一天，取符合免疫質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的Balb/c小鼠，脫頸處死并泡在75%酒精中消毒。

SP2/0細(xì)胞在融合前4—5天復(fù)蘇，培養(yǎng)換液，使細(xì)胞在融合前狀態(tài)良好且處于對數(shù)增長期。

試劑準(zhǔn)備：

取1mL/管50% PEG1450一支，DMEM，F(xiàn)BS-DMEM，F(xiàn)BS-DMEM(HAT)等試劑，均預(yù)熱置37℃

實(shí)驗(yàn)流程：

SP2/0收集：

SP2/0低速離心（1000rpm*5min），棄上清，用DMEM復(fù)懸清洗，再重復(fù)一次此步驟，37℃復(fù)懸備用。

脾細(xì)胞懸液制備：

取免疫完成的小鼠，眼球取血后，浸潤在75%的酒精中消毒滅菌。在無菌條件下取出其脾臟，使用研磨器研磨脾臟，與DMEM混合過篩網(wǎng)制成單個(gè)脾細(xì)胞懸液，低速離心（1000rpm*10min），棄上清，用DMEM清洗并再一次重復(fù)此步驟，37℃復(fù)懸備用。

細(xì)胞融合：

將脾細(xì)胞和SP2/0按照[脾細(xì)胞：SP2/0 = 2:1~3:1]的比例，混合于50ml離心管中低速離心（1000rpm*10min），棄上清且確保管內(nèi)無液體殘留，將細(xì)胞團(tuán)塊輕輕敲散，使脾細(xì)胞 & SP2/0在管底均勻混合鋪開。加入預(yù)熱完成的50% PEG1450 ，在1min內(nèi)逐滴均勻加入，加完后37℃反應(yīng)1min，反應(yīng)完成后加入10~15ml左右終止液（DMEM）終止反應(yīng)，由慢至快逐步滴加，10min全部加入完成。

融合鋪板：

細(xì)胞融合完成后，低速離心（1000rpm*10min），棄上清，使用FBS-DMEM(HAT)復(fù)懸細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，（過程中注意動(dòng)作輕柔，不可用力吹打，以免破壞融合細(xì)胞降低融合率）。將提前一天已加入飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板取出，用吸頭將板內(nèi)培養(yǎng)基上清全部吸出丟棄，將剛制備完成的細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL，轉(zhuǎn)入5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。

融合換液：

融合細(xì)胞在FBS-DMEM(HAT)中培養(yǎng)3~7天，根據(jù)細(xì)胞融合情況，將培養(yǎng)上清吸出丟棄，更換成FBS-DMEM(HT)，每孔200μL。換液后觀察細(xì)胞形態(tài)，根據(jù)細(xì)胞生長情況，在4~7天后用Elisa進(jìn)行融合陽性篩選檢測。

附：可使用到的耐思產(chǎn)品
 

細(xì)胞培養(yǎng)板


移液吸頭  


微量離心管


細(xì)胞培養(yǎng)皿 


細(xì)胞篩