透過單細(xì)胞技術(shù)的歷史沿革發(fā)現(xiàn)預(yù)判腫瘤免疫治療臨床結(jié)局的全新手段

T細(xì)胞亞型作為預(yù)測(cè)免疫治療應(yīng)答的標(biāo)志物

在單細(xì)胞應(yīng)用于免疫治療研究的歷史沿革中，早期基于組織免疫組化的研究證實(shí)了在anti-PD-1治療的應(yīng)答黑色素瘤病人的侵襲腫瘤邊緣， 不管是治療前還是治療后相對(duì)于無應(yīng)答者CD8+ T細(xì)胞在應(yīng)答患者中的增殖會(huì)顯著增加。相一致的，CD8+ T細(xì)胞的效能分子Granzyme B也在應(yīng)答患者免疫治療后顯著增加[1]。

CD8\Ki67雙色免疫組化

 

|   流式分析

然而組織中檢測(cè)并不是一個(gè)最優(yōu)的標(biāo)志物研究方案，2017年Wherry團(tuán)隊(duì)在Nature發(fā)文發(fā)現(xiàn)了黑色素瘤病人外周血中與anti-PD-1或者anti-CTLA-4治療顯著相關(guān)的T細(xì)胞亞型[2]。他們利用高維度的流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)了免疫治療后Ki67+ PD-1+ CD8 T細(xì)胞顯著增多。但是雖然治療后有大約74%的病人外周血中Ki67+ PD-1+ CD8 T細(xì)胞增加，但是僅有38%的病人獲得臨床受益，因此單獨(dú)的Ki67+ PD-1+ CD8 T細(xì)胞并不能預(yù)測(cè)免疫治療效果。這也暗示了可能存在更細(xì)分的細(xì)胞亞群或其他的影響因素與治療效果相關(guān)。研究者之后發(fā)現(xiàn)了Ki67+ PD-1+ CD8 T細(xì)胞與腫瘤負(fù)荷（TB）具有顯著的相關(guān)性。Ki67的高表達(dá)也代表著高的腫瘤負(fù)荷，因此Ki67+ PD-1+ CD8 T細(xì)胞增多反而預(yù)示著預(yù)后不良。最終研究者提出了利用Ki67+ PD-1+ CD8 T細(xì)胞與腫瘤負(fù)荷的比值可以預(yù)測(cè)對(duì)免疫治療的效果，治療后Ki67/TB >1.94的患者具有高的總體生存率。

 

預(yù)測(cè)anti-PD-1治療

除了T細(xì)胞的類型變化，T細(xì)胞的效應(yīng)分子同樣與免疫治療具有相關(guān)性，就像上述CD8+ T細(xì)胞的效能分子Granzyme B。Krieg等利用質(zhì)譜流式（CyTOF）和FlowSOM分析了黑色素瘤病人在anti-PD-1治療前后外周血PBMC中的不同類型的細(xì)胞變化[3]。他們發(fā)現(xiàn)了外周血中總的CD4+ 或CD8+ T細(xì)胞的比率在應(yīng)答患者中顯著下降，但是利用CyTOF分析T細(xì)胞的多種功能細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)了每個(gè)細(xì)胞因子在治療前后的變化不盡一致，但是通過因子組合性的分析方法，研究者發(fā)現(xiàn)了CD4+ T細(xì)胞的3種類型的因子組合在應(yīng)答患者中顯著增加，CD8+ T細(xì)胞有13種類型的因子組合在應(yīng)答患者中顯著增加。這個(gè)研究說明了T細(xì)胞的功能性細(xì)胞因子也可以作為預(yù)測(cè)免疫治療是否應(yīng)答或抵抗。

 

CD8+ T細(xì)胞的不同因子組合（CCG）在應(yīng)答和無應(yīng)答間的差異

 

|   單細(xì)胞測(cè)序

流式分析因其有限的marker限制了新類型細(xì)胞亞型的發(fā)現(xiàn)，而單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（sc-RNA）以無偏的檢測(cè)方式結(jié)合各種高級(jí)的生信分析方法已經(jīng)成為了腫瘤免疫研究領(lǐng)域最常用的技術(shù)手段。Sade-Feldman等人利用sc-RNA測(cè)序分析了轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者在anti-PD1或anti-CTLA4+PD1治療前后組織中的淋巴細(xì)胞（CD45+）[4]。聚焦分析CD8+ T細(xì)胞，結(jié)果鑒別了2種類型的CD8+ T細(xì)胞，其中一類高表達(dá)TGF7基因的CD8+ T細(xì)胞在應(yīng)答患者中顯著增加，通過免疫熒光驗(yàn)證了TCF7+CD8+ T細(xì)胞與免疫治療應(yīng)答具有顯著相關(guān)性，可以作為預(yù)后標(biāo)志物。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了表達(dá)耗竭型marker TIM3 和CD39的CD8+ T細(xì)胞在無應(yīng)答患者中顯著富集。同時(shí)靶向這2個(gè)耗竭型marker可以增加anti-PD1的抗腫瘤效果。

 

sc-RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)免疫治療應(yīng)答的CD8+ T細(xì)胞亞型

|   單細(xì)胞TCR測(cè)序

除了證實(shí)CD8+ T細(xì)胞亞型可以預(yù)測(cè)免疫治療應(yīng)答或抵抗外，另外一個(gè)重要的問題是響應(yīng)免疫治療的T細(xì)胞是來源于預(yù)先存在的腫瘤侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）的重新恢復(fù)，還是征募的新的T細(xì)胞。2019年一項(xiàng)Nature medicine上發(fā)表的研究利用sc-RNA測(cè)序和sc-TCR測(cè)序分析了11個(gè)基底細(xì)胞癌患者anti-PD1治療前后的TILs[5]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了耗竭型CD8+ T細(xì)胞在治療后最為顯著性的增加，這些耗竭型CD8+ T細(xì)胞表達(dá)慢性活化、T細(xì)胞功能障礙和腫瘤反應(yīng)性的基因。結(jié)合TCR測(cè)序發(fā)現(xiàn)了克隆擴(kuò)增最多還是耗竭型CD8+ T細(xì)胞。然而對(duì)比分析治療前和治療后的T細(xì)胞克隆發(fā)現(xiàn)了治療后絕大部分?jǐn)U增的克隆在治療前并不存在，說明了這些擴(kuò)增的克隆是在治療后新形成的。研究者最后還揭示了治療后大約40%的TILs克隆可以在外周血中檢測(cè)到，并且顯著增加的也是耗竭型CD8+ T細(xì)胞。說明了組織中新的T細(xì)胞克隆很可能是來源于外周血。之后2020年Nature上的一項(xiàng)研究證實(shí)了免疫治療后腫瘤組織和癌旁組織中存在共同克隆擴(kuò)增的T細(xì)胞，并且在外周血中也同樣存在[6]。

 

免疫治療后耗竭型CD8+ T細(xì)胞具有最大的克隆擴(kuò)增，并且是由新的克隆替代

 

那么這些外周血中克隆擴(kuò)增的CD8+ T細(xì)胞是否也與免疫治療預(yù)后具有顯著相關(guān)性呢。Fairfax等人對(duì)55個(gè)黑色素瘤病人在anti-PD1或anti-PD1+CTLA4聯(lián)合治療前后的血液CD8+ T細(xì)胞進(jìn)行了常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，證實(shí)了很多編碼TCR的基因在應(yīng)答組中的表達(dá)顯著高于無應(yīng)答者[7]。并且在應(yīng)答患者中存在更多的大的CD8+ T細(xì)胞克隆，大的CD8+ T細(xì)胞克隆越多的患者在治療后的生存率越高。說明了外周血中克隆擴(kuò)增的CD8+ T細(xì)胞可以作為免疫治療的效果的預(yù)測(cè)標(biāo)志物。

外周血中克隆擴(kuò)增的CD8+ T細(xì)胞可以預(yù)測(cè)免疫治療應(yīng)答的標(biāo)志物
 

就像上述的一些研究所述CD8+ T細(xì)胞的功能效應(yīng)因子也與免疫治療的效果具有顯著相關(guān)性。功能障礙的CD8+ T細(xì)胞主要就是因?yàn)椴荒軌虍a(chǎn)生效應(yīng)因子（例如IFN-γ，TNF）和細(xì)胞毒分子（例如granzymes 和perforin），從而失去了殺死腫瘤細(xì)胞的能力。能夠?qū)γ庖咧委熀箜憫?yīng)，說明了CD8+ T細(xì)胞分泌功能性因子的能力增加。因此，這些功能性細(xì)胞因子的分泌結(jié)合T細(xì)胞的變化或許可以更好的預(yù)測(cè)免疫治療應(yīng)答或抵抗。上述有項(xiàng)研究利用質(zhì)譜流式檢測(cè)了細(xì)胞因子，但是質(zhì)譜流式檢測(cè)的畢竟不是活細(xì)胞而且不是真正分泌出的細(xì)胞因子含量，所以需要更合適的技術(shù)檢測(cè)單細(xì)胞的功能性蛋白（細(xì)胞因子）。很多研究通過sc-RNA測(cè)序結(jié)果中這些效應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)推測(cè)CD8+ T細(xì)胞的功能狀態(tài)，但是轉(zhuǎn)錄水平的改變忽視了蛋白修飾和再加工的過程，已經(jīng)有研究報(bào)告了耗竭型CD8+ T細(xì)胞有高表達(dá)mRNA但是幾乎不表達(dá)蛋白或者細(xì)胞毒作用，所以必須謹(jǐn)慎的利用T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)推測(cè)其功能狀態(tài)。如何突破單細(xì)胞功能蛋白組的瓶頸，實(shí)現(xiàn)真正意義上單細(xì)胞層面分泌蛋白組（細(xì)胞因子）的檢測(cè)？去年Nat Rev Clin Oncol發(fā)表的一篇綜述上提到了一項(xiàng)新的技術(shù)IsoPlexis單細(xì)胞功能蛋白組學(xué)[8]，可以同時(shí)檢測(cè)500-1500個(gè)活的單細(xì)胞分泌的32種細(xì)胞因子，對(duì)關(guān)鍵細(xì)胞亞型進(jìn)行功能表征。

 

|   IsoPlexis單細(xì)胞功能蛋白組

2020年發(fā)表在J Clin Oncol雜志上的一項(xiàng)研究就利用單細(xì)胞功能蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)了CD8+ T細(xì)胞的多功能性可以作為NKTR-214（bempegaldesleukin）與Opdivo（nivolumab）免疫組合療法的療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物[9]。研究者分析了血液CD8+和CD4+ T細(xì)胞、NK細(xì)胞，只有多功能性CD8+ T細(xì)胞（分泌≥2個(gè)因子）的比例在客觀緩解的患者一組中顯著升高，在無應(yīng)答的患者中并沒有變化。這也與免疫檢查點(diǎn)抑制主要影響CD8+ T細(xì)胞的結(jié)論相一致。在之后為期3年的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)了CD8+ T細(xì)胞的多功能指數(shù)PSI（多功能性細(xì)胞比例x檢測(cè)因子的信號(hào)強(qiáng)度）差異高的患者表現(xiàn)出更高的客觀緩解率。這些結(jié)果說明了通過Isoplexis單細(xì)胞蛋白組分析得到的CD8+ T細(xì)胞多功能性指數(shù)PSI可成為與患者應(yīng)答相關(guān)的預(yù)測(cè)性標(biāo)志物。
 

CD8+ T細(xì)胞PSI差異大的的患者免疫治療后的客觀緩解率高

外周血中CD8+ T細(xì)胞多功能指數(shù)PSI或許和T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增直接相關(guān)。Axelrod等人利用IsoPlexis分析了4個(gè)乳腺癌病人在新輔助化療前后外周血中的PD1+和PD1-的CD4、CD8 T細(xì)胞[10]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在治療后PD1+ CD8 T細(xì)胞的多功能性顯著增加，通過對(duì)CD8 T細(xì)胞進(jìn)行TCR測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)治療后克隆擴(kuò)增最多的也是PD1+ CD8 T細(xì)胞，而不是PD1- CD8 T細(xì)胞。這就說明了IsoPlexis分析得到T細(xì)胞多功能性指數(shù)與克隆擴(kuò)增具有直接相關(guān)性，是否可以反應(yīng)克隆擴(kuò)增的程度可能需要更多的研究數(shù)據(jù)來驗(yàn)證。

新輔助化療前后PD1+ CD8 T細(xì)胞克隆和多功能性的變化
 

雖然免疫治療主要發(fā)揮效應(yīng)的是CD8+ T細(xì)胞，但是有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了CD4+ T也可以支持免疫治療反應(yīng)。Abbas等人利用IsoPlexis分析了16名急性髓樣淋巴瘤患者在anti-PD1治療前后骨髓中的CD8+和CD4+ T細(xì)胞[11]。發(fā)現(xiàn)了應(yīng)答患者中只有CD4+ T細(xì)胞的多功能指數(shù)PSI顯著增加，與總生存率具有顯著相關(guān)性。每個(gè)因子的貢獻(xiàn)度分析揭示了IFN-γ和TNF-α是驅(qū)動(dòng)CD4+ T細(xì)胞的多功能性增加的主要驅(qū)動(dòng)因子。聚類分析也揭示效應(yīng)性因子在應(yīng)答患者CD4+ T細(xì)胞分泌的因子中占主導(dǎo)。

 

CD4+ T細(xì)胞的多功能性發(fā)生了改變
 

近期J Immunother Cancer雜質(zhì)發(fā)表的一項(xiàng)臨床2期試驗(yàn)中，同樣利用IsoPlexis分析發(fā)現(xiàn)了血液中CD4+ T細(xì)胞的多功能性與免疫治療具有顯著相關(guān)性[12]。這項(xiàng)試驗(yàn)是臨床轉(zhuǎn)化標(biāo)志物的研究，目的是為了預(yù)測(cè)anti-CTLA4或者聯(lián)合anti-PD1治療晚期黑色素瘤病人的應(yīng)答。首先是通過CyTOF發(fā)現(xiàn)了應(yīng)答患者中CD4+ T細(xì)胞在治療后顯著增加，并且主要是中央記憶性T細(xì)胞的增加，不是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。之后IsoPlexis進(jìn)行功能表征分析，一致的，CD4+ T細(xì)胞的PSI在治療后顯著增加，并且主要是效應(yīng)性因子的增加，調(diào)節(jié)性因子反而在應(yīng)答患者中是下降的，這也與CyTOF的結(jié)果相一致。

 

CyTOF和IsoPlexis聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)CD4+ T細(xì)胞多功能性在免疫治療后顯著增加

 

對(duì)于靶向免疫抑制檢查點(diǎn)治療抵抗的病人，可以采用TIL的過繼細(xì)胞療法。Nature medicine上發(fā)表了一項(xiàng)臨床1期試驗(yàn)，評(píng)估了TIL 過繼細(xì)胞療法處理anti-PD1治療后疾病還進(jìn)展的病人[13]。活性評(píng)估發(fā)現(xiàn)了69%（11/16）的病人發(fā)生了腫瘤消退。為了評(píng)估TIL 過繼細(xì)胞療法對(duì)體內(nèi)T細(xì)胞功能的影響，研究者利用IsoPlexis分析了其中12名患者用藥進(jìn)程不同階段血液中CD8+和CD4+ T細(xì)胞的多功能性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了TIL 過繼細(xì)胞療法主要是增加CD8+ T細(xì)胞的多功能性。同樣的，流式細(xì)胞術(shù)分析也展示了TIL 過繼細(xì)胞療法主要增加的是效應(yīng)性CD8+ T細(xì)胞。這說明了IsoPlexis分析得到的多功能性指數(shù)PSI與細(xì)胞表型相一致。

 

TIL 過繼細(xì)胞療法主要持續(xù)增加CD8+ T細(xì)胞的多功能性

 

在評(píng)估免疫細(xì)胞與腫瘤免疫治療間的相關(guān)性上，研究的趨勢(shì)已經(jīng)從僅僅的細(xì)胞表型特征關(guān)聯(lián)向細(xì)胞功能特征關(guān)聯(lián)發(fā)展。IsoPlexis單細(xì)胞功能蛋白組學(xué)可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)500-1500單個(gè)細(xì)胞分泌的32種功能蛋白的檢測(cè)，其提供的蛋白質(zhì)組學(xué)功能層面的數(shù)據(jù)，與臨床結(jié)果具有顯著相關(guān)性。特別是在腫瘤免疫領(lǐng)域，對(duì)T細(xì)胞功能表征研究具有革命性的改變。

 

 

|   相關(guān)文獻(xiàn)

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