環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)原理淺析
01 DNA及其擴(kuò)增的幾個(gè)基本規(guī)則
1.DNA雙鏈的互補(bǔ)性與方向性：
自然界的大多數(shù)DNA都以雙鏈形式存在：正負(fù)配對(duì)，就像一對(duì)磁鐵。而且正負(fù)鏈的方向相反，一個(gè)從左往右，一個(gè)從右往左。DNA鏈的序列稱為一級(jí)結(jié)構(gòu)，正負(fù)鏈之間會(huì)形成很多氫鍵（虛線）來(lái)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，形成“二級(jí)結(jié)構(gòu)”。而圖2中的DNA單鏈自身就會(huì)通過(guò)序列互補(bǔ)形成“啞鈴”型的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
圖1：DNA雙鏈和正負(fù)鏈通過(guò)氫鍵（虛線）結(jié)合，1234都是鏈中任意的序列
圖2：DNA一級(jí)序列通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)
2.DNA擴(kuò)增需要“引物”，且只能延一個(gè)方向擴(kuò)增：
引物是人工合成的可以和長(zhǎng)DNA鏈互補(bǔ)的短序列，目的是實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。DNA擴(kuò)增的這種特性主要由DNA聚合酶決定。DNA聚合酶——無(wú)論是PCR中的Taq酶，還是LAMP中的Bst酶，都需要識(shí)別引物來(lái)開(kāi)始序列擴(kuò)增。引物的末端有暴露的-OH羥基，是DNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)之一。聚合酶會(huì)在引物后端按照模板互補(bǔ)擴(kuò)增，直至無(wú)鏈可擴(kuò)。為了方便起見(jiàn)，本文中所有結(jié)合了DNA聚合酶并且可以擴(kuò)增的唯一方向都用紅色箭頭表示，且當(dāng)擴(kuò)增結(jié)束時(shí)，紅色箭頭會(huì)變?yōu)槠胀ǖ哪┒�，不能繼續(xù)延伸。
圖3 引物、DNA聚合酶和擴(kuò)增方向（√符號(hào)示意）
3.Bst DNA聚合酶的“鏈置換活性”：
氫鍵是一種可強(qiáng)可弱的相互作用力，在高溫時(shí)會(huì)斷開(kāi)，降溫時(shí)會(huì)穩(wěn)定，而LAMP的反應(yīng)溫度則處于兩者之間（65℃），因此LAMP反應(yīng)中的氫鍵理論上處于一種動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)。LAMP中使用的Bst DNA聚合酶具有很強(qiáng)的“鏈置換活性”，兩條鏈之間氫鍵可能會(huì)在斷開(kāi)后立馬和其它鏈形成新的氫鍵（圖4）
圖4 Bst聚合酶的鏈置換活性
02“啞鈴型”核酸結(jié)構(gòu)開(kāi)始的LAMP擴(kuò)增
2.1臨床檢查
現(xiàn)在我們就可以來(lái)看看LAMP是如何通過(guò)巧妙的設(shè)計(jì)來(lái)完成等溫?cái)U(kuò)增。與大多數(shù)敘述LAMP的文章不同，本文直接從LAMP擴(kuò)增最關(guān)鍵的“啞鈴型”核酸入手，將它作為起點(diǎn)，來(lái)分解LAMP的擴(kuò)增原理。筆者自制了反應(yīng)過(guò)程中的中間結(jié)構(gòu)（.5與.75結(jié)構(gòu)）以幫助理解。
這個(gè)“啞鈴型”核酸就是剛才見(jiàn)過(guò)的自帶雙環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA，它的兩端可以自身配對(duì)，這種結(jié)構(gòu)恰恰就自帶引物結(jié)構(gòu)，提供擴(kuò)增的起始位點(diǎn)（圖5）。
圖5 啞鈴型核酸以自身為模板的擴(kuò)增（1）→（2）
LAMP中并不是沒(méi)有引物，但它的引物有雙重作用，其中之一就是與結(jié)構(gòu)（2）中存在的單環(huán)結(jié)合完成擴(kuò)增形成結(jié)構(gòu)（3）（圖6）。
圖6 結(jié)構(gòu)（2）→（3）：（2.5）隨著下方鏈的擴(kuò)增、上方的鏈會(huì)逐漸解離，
并在解離完成后自身形成環(huán)結(jié)構(gòu)
結(jié)構(gòu)（3）自身又自帶引物，可以擴(kuò)增為結(jié)構(gòu)（4）（圖7）。在結(jié)構(gòu)（4）產(chǎn)生的同時(shí)，也會(huì)釋放出一條結(jié)構(gòu)（4*），它也是可以形成啞鈴型結(jié)構(gòu)核酸分子，從而可以同步獨(dú)立完成從結(jié)構(gòu)（1）~結(jié)構(gòu)（4）的擴(kuò)增。
圖7 結(jié)構(gòu)（3）→（4），并形成一個(gè)新的啞鈴結(jié)構(gòu)分子
結(jié)構(gòu)（4）上的單環(huán)又可以和體系中的另一個(gè)引物結(jié)合，形成結(jié)構(gòu)（5）（圖8）。以此類推，之后的結(jié)構(gòu)會(huì)變得較為復(fù)雜，感興趣的朋友可以參考T. Notomi等人發(fā)表的原文獻(xiàn)插圖。相信有本文的引導(dǎo)，看懂他們的插圖應(yīng)該不成問(wèn)題。
啞鈴型結(jié)構(gòu)的DNA每進(jìn)行3次擴(kuò)增就會(huì)額外形成一個(gè)新的啞鈴型結(jié)構(gòu)，且原結(jié)構(gòu)會(huì)繼續(xù)延長(zhǎng)，最后形成若干首尾相連的“菜花型”結(jié)構(gòu)，并在此過(guò)程中同時(shí)產(chǎn)生新的可以獨(dú)立擴(kuò)增的額外模板，目標(biāo)DNA會(huì)指數(shù)擴(kuò)增到檢測(cè)限。
由此可見(jiàn)，LAMP擴(kuò)增的最終產(chǎn)物是一堆長(zhǎng)短不一的混合物，這注定了LAMP只能用于檢測(cè)，而不能用于基因克隆。但LAMP擴(kuò)增使用到4~6個(gè)引物，大大增加了擴(kuò)增的特異性。更多的應(yīng)用可以在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）簡(jiǎn)介一文中閱讀。
圖8 結(jié)構(gòu)（4）→（5）
圖9 任意DNA序列+引物→啞鈴型結(jié)構(gòu)
附：可使用到的耐思產(chǎn)品
PCR管
移液槍頭
