Cell：葡萄糖直接結(jié)合DDX21調(diào)節(jié)mRNA剪接和組織分化

葡萄糖是機(jī)體能量的主要來源，經(jīng)過代謝產(chǎn)生ATP支持各種生命活動(dòng)，如酶促合成、胞內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞增殖等。然而，它在控制蛋白質(zhì)相互作用方面的作用沒有得到重視。

2022年11月，斯坦福大學(xué)的研究人員在bioRxiv上刊發(fā)了題為“Glucose modulates transcription factor dimerization to enable tissue differentiation”的文章，發(fā)現(xiàn)葡萄糖會(huì)在包括表皮在內(nèi)的多種組織的分化細(xì)胞中積累并未引起代謝的增加，暗示葡萄糖本身可以作為分化過程的分子信號(hào)，作者還發(fā)現(xiàn)葡萄糖可以直接結(jié)合分化轉(zhuǎn)錄因子IRF6，增強(qiáng)分化基因的誘導(dǎo)。上述觀察表明葡萄糖的直接結(jié)合可能重塑分化必需蛋白的功能。

上述發(fā)現(xiàn)促使該團(tuán)隊(duì)繼續(xù)找尋新的葡萄糖結(jié)合蛋白。2023年1月，該課題組在Cell發(fā)表了題為“Glucose dissociates DDX21 dimers to regulate mRNA splicing and tissue differentiation”的研究，發(fā)現(xiàn)葡萄糖解聚DDX21二聚體來調(diào)節(jié)mRNA剪接和組織分化。

研究人員確定了葡萄糖與各種RNA結(jié)合蛋白（RBP）的結(jié)合，包括DDX21 RNA螺旋酶，該酶被認(rèn)為對(duì)表皮分化至關(guān)重要。葡萄糖與DDX21的ATP結(jié)合域結(jié)合，改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，抑制了螺旋酶的活性，并使DDX21二聚體解離。在分化過程中，葡萄糖的升高與DDX21從核仁到核質(zhì)的重新定位有關(guān)，DDX21在核質(zhì)中組裝成含有RNA剪接因子的較大的蛋白質(zhì)復(fù)合物。DDX21以葡萄糖依賴的方式定位于mRNA內(nèi)含子中特定的SCUGSDGC結(jié)構(gòu)域，并促進(jìn)關(guān)鍵的促分化基因的剪接，包括GRHL3、KLF4、OVOL1和RBPJ。上述發(fā)現(xiàn)揭示出葡萄糖在調(diào)節(jié)組織分化相關(guān)的RNA解旋酶二聚化和功能中的作用機(jī)制。

 

1、DDX21作為葡萄糖的直接結(jié)合蛋白

研究通過兩種方法確定葡萄糖互作蛋白：1）親和層析純化葡萄糖結(jié)合蛋白；2）利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)抓取天然細(xì)胞內(nèi)可與疊氮葡萄糖結(jié)合的蛋白（圖1A）。經(jīng)質(zhì)譜分析獲得目的蛋白，兩種方法同時(shí)捕獲到的蛋白共有91種，其中大部分為RNA結(jié)合蛋白，含量最豐富的是DDX21（圖1B、C）。由于RNA解旋酶的結(jié)構(gòu)十分保守，層析法中還富集到另外31種RNA解旋酶，說明解旋酶是一類新發(fā)現(xiàn)的葡萄糖結(jié)合蛋白。接著通過微量熱泳動(dòng)（MST）（圖1D）和熒光淬滅（Fluorescence quenching）（圖1E）分析證實(shí)葡萄糖可結(jié)合DDX21，親和力在微摩爾級(jí)別。

圖1 篩選葡萄糖直接結(jié)合的蛋白

2、葡萄糖結(jié)合到DDX21的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域影響其核仁到核質(zhì)的重定位

ATP酶活性實(shí)驗(yàn)顯示葡萄糖和ATP競爭結(jié)合DDX21（圖2A），突變體結(jié)合實(shí)驗(yàn)提示DDX21結(jié)合葡萄糖需要其ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的某些序列（圖2B）。分子對(duì)接（圖2C）和質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析（圖2D）確認(rèn)葡萄糖結(jié)合DDX21的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域。微量熱泳動(dòng)（MST）（圖2E）、免疫共沉淀和非變性膠實(shí)驗(yàn)顯示葡萄糖可抑制DDX21的二聚化�；罴�(xì)胞中的臨近連接實(shí)驗(yàn)（PLA）顯示在細(xì)胞分化過程中胞內(nèi)的葡萄糖濃度升高，DDX21二聚體出現(xiàn)得更少，免疫熒光顯示DDX21單體主要存在于核質(zhì)（圖2F）�？傊�，葡萄糖結(jié)合到DDX21的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域會(huì)改變其蛋白構(gòu)象，影響其核仁到核質(zhì)的重定位。

圖2 葡萄糖結(jié)合到DDX21的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域影響其核仁到核質(zhì)的重定位

 

最后，作者通過敲除實(shí)驗(yàn)證實(shí)DDX21是表皮分化必需的。進(jìn)一步分析DDX21在葡萄糖調(diào)控的mRNA剪接中的作用，發(fā)現(xiàn)葡萄糖可能促使DDX21結(jié)合到某些特定的mRNA內(nèi)含子以促使其剪接，而DDX21調(diào)節(jié)分化過程中的RNA剪接至少部分是通過直接結(jié)合葡萄糖來實(shí)現(xiàn)的，如對(duì)表皮分化和功能相關(guān)基因（如GRHL1-3、KLF4、OVOL1、RBPJ、JAG1、NOTCH3），DDX21會(huì)改變其分化相關(guān)外顯子的使用或內(nèi)含子的保留。

葡萄糖抑制DDX21二聚化發(fā)揮作用的模式圖如下：

葡萄糖抑制DDX21二聚化發(fā)揮作用的模式圖

 

                                                           總結(jié)與討論

該研究挑戰(zhàn)了人們對(duì)葡萄糖的固有認(rèn)知并提出代謝物可作為蛋白功能調(diào)節(jié)器的可能性，同時(shí)推測葡萄糖很可能還參與多種細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)，并可能影響基因表達(dá)的不同步驟，從轉(zhuǎn)錄到轉(zhuǎn)錄后RNA代謝。代謝物不僅是機(jī)體表型的標(biāo)志物，還可與蛋白直接結(jié)合調(diào)控蛋白功能，改變疾病相關(guān)信號(hào)通路，影響疾病進(jìn)展。前期我們已經(jīng)分享過一篇文獻(xiàn)“代謝組學(xué)研究2.0時(shí)代已經(jīng)到來：發(fā)現(xiàn)代謝小分子的靶點(diǎn)蛋白是關(guān)鍵”，其中列舉了多篇高水平的文章，并揭示通過發(fā)現(xiàn)代謝物的直接作用靶點(diǎn)用以解釋代謝物的功能已成為高水平研究的標(biāo)配。

在此，達(dá)吉特可通過代謝組學(xué)技術(shù)幫助大家實(shí)現(xiàn)相關(guān)代謝物的確定：

1）有機(jī)酸和TCA循環(huán)類物質(zhì)檢測，包括葡萄糖、乳糖、丙酮酸、琥珀酸等13種代謝物；

2）能量代謝類物質(zhì)檢測列表，包括糖酵解、戊糖磷酸途徑、TCA循環(huán)、其他氨基酸等26種代謝物；

3）Q300：達(dá)吉特推薦的全靶向代謝芯片專利技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)300+關(guān)鍵代謝物進(jìn)行廣泛篩選和絕對(duì)定量，幾乎覆蓋95%的經(jīng)典代謝通路。檢測代謝物種類包含氨基酸（60+種）、有機(jī)酸（30+種）、脂肪酸（65+種）、糖類（25+種）、膽汁酸（50+種）、肉堿（20+種）、苯基或芐基衍生物（25+種）、吲哚（5+種）等。

2、代謝物小分子的直接靶點(diǎn)篩選與驗(yàn)證

在確定代謝物小分子以后，可通過20K人類蛋白質(zhì)組芯片、Pull down+MS、DARTS+MS等技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝物直接靶蛋白的篩選，進(jìn)一步可通過分子對(duì)接、SPR、ITC、CETSA、Pulldown+WB等方法進(jìn)行驗(yàn)證，而其中最常用的驗(yàn)證手段為SPR。

達(dá)吉特同樣提供代謝小分子后續(xù)相匹配的直接靶點(diǎn)篩選及驗(yàn)證服務(wù)，通過“代謝組學(xué)+20K芯片+SPR”為大家解決差異代謝物篩選及其直接靶點(diǎn)篩選和驗(yàn)證的問題。

達(dá)吉特專注于藥靶研究，可為您尋找藥物靶點(diǎn)提供多種多樣的專業(yè)的技術(shù)服務(wù)和解決方案，助您解決藥物靶點(diǎn)-機(jī)理研究中的各種難題。

達(dá)吉特針對(duì)于中藥及小分子藥物研究，建立了一套完整的技術(shù)服務(wù)體系：

1）中藥/復(fù)方的有效成分及代謝產(chǎn)物分離與鑒定；

2）血清/組織藥代動(dòng)力學(xué)分析

3）小分子化合物生物素批量標(biāo)記

4） 小分子靶點(diǎn)篩選：20K芯片，DARTS/Pull down+質(zhì)譜

5）藥物調(diào)控信號(hào)通路篩選：磷酸化抗體芯片，蛋白質(zhì)組學(xué)

6）網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與計(jì)算機(jī)分子對(duì)接

7）SPR表面等離子共振（分子動(dòng)力學(xué)）

8）天然產(chǎn)物化合物庫與功能化合物篩選服務(wù)

 

相關(guān)文獻(xiàn)

Miao W, Porter DF, Lopez-Pajares V, et al. Glucose dissociates DDX21 dimers to regulate mRNA splicing and tissue differentiation. Cell. 2023 Jan 5;186(1):80-97.e26.