人腦脊液的代謝組學(xué)研究應(yīng)用：為神經(jīng)性疾病生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供參考

百趣代謝組學(xué)分享，腦疾病病人的腦脊液（CSF）通常用來診斷和監(jiān)測研究，但是惡性膠質(zhì)瘤病人腦脊液組成的變化很少被人們所知。該研究作者建立了靶向代謝組學(xué)分析方法，采用SRM監(jiān)測模式，使用正負(fù)離子切換的方法在CSF中鑒定到了124種極性代謝物。樣品來源于10例膠質(zhì)瘤病人與7例對照。百趣代謝組學(xué)解讀，采用多種統(tǒng)計手段對數(shù)據(jù)進行分析，為神經(jīng)性疾病生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供參考。

10位膠質(zhì)瘤病人包含4例新診斷的膠質(zhì)瘤病人及6例復(fù)發(fā)病人。7例對照未診斷出任何膠質(zhì)瘤。除了3號病人通過腦室采集CSF外，其余均通過腰椎穿刺采集。樣品采自27-67歲的男性和女性患者，樣品保存于-80℃冰箱直至測定。同時測定了一些臨床指標(biāo)如白細(xì)胞計數(shù)、血清總蛋白水平、血糖水平、LDH水平等（見表1）。測定的腫瘤指標(biāo)包括腫瘤進程、生存期、腫瘤大小等。對于CSF的前處理，作者向250μL腦脊液樣品中加入80%甲醇，-20℃下沉淀蛋白過夜。之后在4℃下13000rpm離心10min。取上清液吹干，用50μL水-乙腈（95:5）復(fù)溶。13000rpm離心5min，取上清液吹干，保存于-80℃冰箱。樣品用20μL水（質(zhì)譜級）復(fù)溶，取10μL進液質(zhì)分析。
 

表1膠質(zhì)瘤病人的基本信息及臨床參數(shù)

圖1 CSF代謝物組成的分層聚類分析

作者也進行了PCA分析，發(fā)現(xiàn)前3種主成分表現(xiàn)出顯著性差異（*，p=8.3×10-15; ** ,p=2.6×10-5; ***, p=1.8×10-9），分別占變異的28.1%、15.3%、13.9%（圖2A）。為了進一步解釋這些成分，作者將前40個主成分導(dǎo)入KEGG數(shù)據(jù)庫，得到代謝物的通路分析結(jié)果。其中嘧啶代謝對2種主成分都做出了貢獻（圖2C）。代謝物來自三羧酸循環(huán)（n=5）、糖異生（n=4）、嘧啶代謝（n=4）為第一個主成分做出貢獻；代謝物來自尿素循環(huán)（n=4）、嘧啶代謝（n=4）為第2種主成分做出貢獻；代謝物來自蛋白質(zhì)生物合成（n=7）、尿素循環(huán)（n=4）、嘌呤代謝（n=4）為第3種主成分做出了貢獻。這些發(fā)現(xiàn)說明體內(nèi)生化反應(yīng)可以區(qū)分膠質(zhì)瘤和正常樣本。

代謝物在前兩種主成分下的得分圖如圖2D，可以看出膠質(zhì)瘤病人聚成兩簇，并且與正常樣本相區(qū)分。采用k均值聚類分析，將不同化合物對各簇的貢獻標(biāo)示以不同的顏色，發(fā)現(xiàn)結(jié)果相同。說明無論是分層聚類、PCA還是k均值聚類分析都可以獲得相同的結(jié)果，只是利用數(shù)據(jù)的不同方面。
 

圖2 CSF代謝物組成的PCA分析及k均值聚類分析

作者接下來分析了膠質(zhì)瘤與正常樣本存在差異的化合物，采用雙側(cè)t檢驗分析，39個化合物存在顯著性差異（p<0.05）（圖3A，表2）。這些代謝物來源于多種代謝途徑，包括氨基酸、脂質(zhì)、嘧啶、中心碳原子代謝。膠質(zhì)瘤對代謝的改變直接來源于體細(xì)胞突變，比如MYC擴增、PTEN缺失、蛋白質(zhì)丟失、EGFR擴增、IDH1/IDH2突變。

代謝組學(xué)分享，作者在3號病人腦脊液中檢測到高水平的2-羥戊二酸，說明此病人可能是IDH1突變的膠質(zhì)瘤；腫瘤復(fù)發(fā)病人（3、10號）樣本中發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)中的代謝物顯著富集（圖3B），說明這些化合物可以用來提示腫瘤復(fù)發(fā)的可能；新診斷的膠質(zhì)瘤病人中發(fā)現(xiàn)有7種代謝物與復(fù)發(fā)病人存在顯著性差異（p<0.05）（圖3C）。其中有很多代謝物涉及組氨酸和色氨酸代謝，包括吲哚乙酸、吲哚、組氨酸、鄰氨基苯甲酸鹽。這條代謝途徑中的吲哚2,3加氧酶通常作為免疫功能的一個生物標(biāo)志物，故上述代謝物水平的變化可以反映這些病人的免疫功能變化。
 

表2膠質(zhì)瘤病人與對照組相比代謝物的變化情況

圖3惡性膠質(zhì)瘤類型的代謝物特征分析及與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

與臨床參數(shù)的相關(guān)性：臨床上采用兩個參數(shù)來評價膠質(zhì)瘤病人的腫瘤大小，分別是Tgad和FLAIR。代謝組學(xué)分享，作者將以上兩種手段觀察到的腫瘤大小與檢測的代謝物關(guān)聯(lián)起來，發(fā)現(xiàn)有8個代謝物與Tgad相關(guān)，10個代謝物與FLAIR相關(guān)（R2>0.50）。并且有6個代謝物與Tgad和FLAIR均相關(guān)， 4個呈正相關(guān)，2個呈負(fù)相關(guān)；另一感興趣的指標(biāo)是生存期，作者發(fā)現(xiàn)有14個代謝物與生存期相關(guān)（R2>0.50）。（表3）其中3個代謝物（泛酸酯、生物素、氨基乙磺酸）可從食物中攝取故在CSF中能夠檢測到，其余代謝物為核苷酸和氨基酸代謝的中間產(chǎn)物。

CSF中肌醇水平降低，膽固醇硫酸酯水平升高與Tgad和FLAIR檢測到的腫瘤大小呈線性相關(guān)（圖3D）。代謝組學(xué)分享，肌醇是一個腦滲透性化合物，用磁共振光譜檢測，其在惡性膠質(zhì)瘤和細(xì)胞瘤中的水平比低級別膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的水平低。該研究也顯示腫瘤大小與CSF中肌醇水平呈負(fù)相關(guān)；CSF中膽固醇硫酸酯水平與腫瘤大小正相關(guān)。膽固醇硫酸酯參與人支氣管上皮細(xì)胞鱗狀上皮生化過程，這也就暗示該代謝物來自正常組織的致癌性轉(zhuǎn)化。

表3與臨床指標(biāo)Tgad、FLAIR、生存期相關(guān)的代謝物

作者等人用惡性膠質(zhì)瘤的小組樣本，構(gòu)建了人腦脊液的整體代謝組學(xué)輪廓。研究發(fā)現(xiàn)，用少量樣本即可以顯著區(qū)分膠質(zhì)瘤病人與正常病人。開發(fā)了一種正負(fù)離子模式切換的LC-MS/MS方法用于代謝物檢測。采用無監(jiān)督的分類算法來尋找病人樣本間的總體差異，并研究與系統(tǒng)性癌癥相關(guān)代謝的生理學(xué)特點。盡管該研究中的樣本量較小，但某些代謝物水平的顯著差異暗示從腦脊液中發(fā)現(xiàn)代謝生物標(biāo)志物有很大潛力，代謝物特征同樣可以作為診斷標(biāo)志物。代謝組學(xué)分享，作者等人希望該研究可以擴展代謝組學(xué)技術(shù)的適用性，并且促進CSF中的代謝物分析為未來大樣本的腫瘤學(xué)臨床研究提供參考。

參考文獻：Jason W. Locasale, Tamar Melman, Susan Song,etal. Metabolomics of Human Cerebrospinal Fluid Identifies Signatures of Malignant Glioma. [J]. Mol. Cell. Proteomics 11, 2012, 1–12.