代謝組學(xué)在揭示水稻“生長-防御”平衡調(diào)控機(jī)制研究中的應(yīng)用

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)科研團(tuán)隊(duì)揭示水稻“生長—防御”平衡調(diào)控機(jī)制！
文章標(biāo)題：Rice cellulose synthase-like protein OsCSLD4 coordinates the trade-off between plant growth and defense
發(fā)表期刊：Frontiers in Plant Science
影響因子：6.627
作者單位：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
百趣生物提供服務(wù)：植物阿趣廣靶®代謝組學(xué)

1.代謝組學(xué)分享-研究背景
通常植物防御能力的提升伴隨著生長和繁殖成本的降低，這是一種在不利條件下微妙的適應(yīng)性機(jī)制，被稱為生長-防御權(quán)衡機(jī)制。纖維素合成酶類蛋白（cellulose synthase-like D4, OsCSLD4）通過調(diào)節(jié)細(xì)胞壁多糖的合成，在水稻的植物結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。代謝組學(xué)分享，近期研究表明，OsCSLD4通過介導(dǎo)脫落酸的生物合成參與水稻的鹽脅迫反應(yīng)。然而，OsCSLD4在水稻對(duì)生物脅迫反應(yīng)中的作用機(jī)制尚未可知。在本研究中，利用合江19號(hào)水稻突變體中的葉片（dwarf and narrowed leaf in Hejiang 19 mutant, dnl19）來確定OsCSLD4在水稻生長和防御之間發(fā)生的作用，揭示了OsCSLD4在調(diào)控水稻生長和防御之間的平衡中的分子機(jī)理。

2.代謝組學(xué)分享-主要實(shí)驗(yàn)

3.代謝組學(xué)分享-研究結(jié)果 水稻dnl19突變體的多態(tài)性表型
本研究檢測(cè)了dnl19突變體的旗葉長度和寬度、圓錐花序長度和節(jié)間伸長率。結(jié)果表明，在整個(gè)發(fā)育期，dnl19突變型水稻比野生型（wild type,WT）矮（圖1）。代謝組學(xué)分享，另外，與WT相比，dnl19突變體植株的葉寬、穗長、結(jié)實(shí)率以及粒徑受到影響，粒寬和千粒重顯著下降�？傊�，dnl19突變體植株表型整體上有很大變化。
 

圖1. dnl19突變體的表征 dnl19中葉脈圖案和節(jié)間細(xì)胞大小的改變

通過對(duì)葉片等部位進(jìn)行組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)突變株小葉脈減少進(jìn)而引起窄葉表型變化，而透明細(xì)胞的顯著減小引起中葉脈厚度的減小。代謝組學(xué)分享，并且，dnl19突變株在葉脈區(qū)具有明顯比野生型更小的泡狀細(xì)胞，這表明dnl19葉片容易卷曲。對(duì)第二節(jié)間縱切面的檢測(cè)結(jié)果表明，細(xì)胞數(shù)量減少導(dǎo)致第二節(jié)間長度縮短。
 

圖2. dnl19突變體對(duì)葉片和莖稈結(jié)構(gòu)的影響

dnl19突變體T-DNA插入的基因組側(cè)翼序列的分離
通過高效熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)dnl19突變體的T-DNA插入位點(diǎn)進(jìn)行鑒定。代謝組學(xué)分享，結(jié)果顯示，T-DNA插到了CHR702的內(nèi)含子區(qū)域。研究證明，T-DNA插入突變體以及CHR702敲除未引起任何形態(tài)上的差異變化。此外，部分未經(jīng)轉(zhuǎn)基因的dnl19也具有矮小的形態(tài)。因此，推測(cè)CHR702不是dnl19突變體的致病基因。

通過MutMap分析鑒定dnl19突變體的候選區(qū)域和致病SNPs
通過分別對(duì)合江19號(hào)、dnl19突變株、正常組和矮化組樣品進(jìn)行測(cè)序深度為30×的全基因組重排分析。代謝組學(xué)分享，結(jié)果表明，在候選區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性（SNP）中，大多數(shù) SNP指數(shù)差異（△SNP指數(shù)）大于0.6的基因位于非編碼區(qū)。位于22,606,187號(hào)核苷酸位置的SNP位于基因OsCSLD4的第一外顯子中。先前的研究表明該基因具有調(diào)節(jié)細(xì)胞壁多糖合成的功能。在密碼子302處有一個(gè)C堿基缺失引起移碼，并且過早引入了一個(gè)終止密碼子。測(cè)序分析證實(shí)突變位點(diǎn)和C堿基缺失可能是dnl19突變體表型異常的原因。

為了挽救dnl19突變體的各種發(fā)育缺陷，作者在玉米泛素啟動(dòng)子的控制下在dnl19 植物中表達(dá)了OsCSLD4。代謝組學(xué)分享，將該基因成功引入突變體dnl19后，dnl19的表型被完全抑制。至于植株高度和葉片的形態(tài)特征，各植株間沒有差異。

表1. 染色體基因組中△SNP指數(shù)>0.6的SNP的候選基因

圖3. dnl19突變體的致病基因（OsCSLD4） 通過RNA測(cè)序?qū)�dnl19突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析

在植物中，生長發(fā)育受損通常伴隨著防御能力增強(qiáng)。為明確OsCSLD4是否參與水稻防御反應(yīng)，本文作者利用RNA-seq技術(shù)對(duì)抽穗期dnl19和WT旗葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)，并結(jié)合qPCR技術(shù)檢測(cè)dnl19和WT在幼苗期和分蘗期的一些防御反應(yīng)基因的表達(dá)水平。代謝組學(xué)分享，dnl19的PR基因（致病相關(guān)基因）在14日齡時(shí)顯著上調(diào)。PR基因中的其他基因在幼苗期和分蘗期都有不同程度地增加。這些結(jié)果都表明dnl19中 OsCSLD4 的破壞激活了防御反應(yīng)基因的表達(dá)。
 

圖4. dnl19突變體和野生型的轉(zhuǎn)錄組分析

dnl19突變體對(duì)稻瘟病和水稻黃單胞菌的抗性發(fā)生改變
作者在苗期通過打孔接種對(duì)dnl19進(jìn)行抗稻瘟病的能力評(píng)估。結(jié)果表明，接種稻瘟病菌110-2菌株后，dnl19葉片的病斑明顯減少。對(duì)每個(gè)病斑的相對(duì)真菌生物量進(jìn)行研究，突變體葉片中生長的真菌較少。作者還評(píng)估了dnl19突變體對(duì)白葉枯病的抗性。通過檢測(cè)分蘗期接種PXO99的日本晴葉片中OsCSLD4的表達(dá)。代謝組學(xué)分享，結(jié)果顯示，處理48小時(shí)后的OsCSLD4表達(dá)顯著增加。然后通過頂切方法將PXO99接種到dnl19突變體的旗葉上。接種2周后，dnl19的病斑長度顯著短于WT。以上結(jié)果表明OsCSLD4基因功能的缺失增強(qiáng)了水稻的抗病性。

圖5. dnl19突變體和野生型對(duì)稻瘟病和水稻黃單胞菌的抗性表征

dnl19突變體的代謝分析
為了了解OsCSLD4突變的代謝反應(yīng)，作者應(yīng)用廣泛靶向代謝組學(xué)來研究dnl19突變體的變化情況（圖6）。在dnl19突變體中共鑒定出69種不同差異代謝物。代謝組學(xué)分享，其中，上調(diào)的差異代謝物有26種，包括L-纈氨酸、L-天冬酰胺、L-組氨酸、L-丙氨酸、龍膽酸和其他重要代謝產(chǎn)物；下調(diào)的差異代謝物有43種，包括L-天冬氨酸、蘋果酸、6-磷酸葡萄糖酸、6-磷酸葡萄糖、1-磷酸半乳糖、葡萄糖酸、D-天冬氨酸等（圖6C）。分析結(jié)果表明，dnl19中OsCSLD4的破壞導(dǎo)致L-纈氨酸、L-天冬酰胺、L-組氨酸、L-丙氨酸、龍膽酸的顯著增加，但L-天冬氨酸、蘋果酸、6-磷酸葡萄糖酸、6-磷酸葡萄糖、1-磷酸半乳糖、葡萄糖酸、D-天冬氨酸的顯著減少。
 

圖6. dnl19突變體的廣泛靶向代謝組學(xué)分析

4.代謝組學(xué)分享-結(jié)論
本研究利用dnl19進(jìn)行基因組學(xué)和代謝組學(xué)的研究分析，探討了OsCSLD4在平衡水稻生長和防御之間的權(quán)衡中的重要性。代謝組學(xué)分享，一般來說，細(xì)胞壁多糖合成酶在水稻生長和非生物脅迫中具有關(guān)鍵作用，在病原體感染期間，特定低聚糖作為主要的植物源性損傷相關(guān)模式分子（damageassociated molecular pattern, DAMP）產(chǎn)生，并可以激活植物免疫反應(yīng)。然而，尚不清楚細(xì)胞壁生物合成缺陷的dnl19或其他OsCSLD4缺失突變體是否也會(huì)釋放或提供寡糖信號(hào)分子的前體，以組成性地觸發(fā)植物防御反應(yīng)，還需要進(jìn)一步研究。