文獻(xiàn)解讀：微量樣本甲基化測(cè)序在腫瘤中的應(yīng)用

本期我們通過(guò)3篇高分文章來(lái)解讀微量樣本甲基化測(cè)序在腫瘤中的應(yīng)用。
 
01 肝細(xì)胞癌診斷和預(yù)后
大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。本期我們通過(guò)3篇高分文章來(lái)解讀微量樣本甲基化測(cè)序在腫瘤中的應(yīng)用。
 

標(biāo)題：Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma（循環(huán)腫瘤DNA甲基化標(biāo)志物在肝細(xì)胞癌診斷和預(yù)后中的價(jià)值）
期刊：Nature materials
2021影響因子: 43.841
發(fā)表時(shí)間：2017.11

摘要：
目前還沒(méi)有一種有效的基于血液的方法來(lái)診斷和判斷肝細(xì)胞癌(HCC)的預(yù)后。攜帶癌癥特異性遺傳和表觀遺傳突變的循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)可以實(shí)現(xiàn)非侵入性的“液體活檢”，用于癌癥的診斷和監(jiān)測(cè)。在這里，作者通過(guò)比較肝癌組織和正常白細(xì)胞，確定了一組肝癌特異性甲基化標(biāo)志物，并顯示肝癌腫瘤DNA和匹配的血漿ctDNA的甲基化特征高度相關(guān)。利用來(lái)自1,098例肝癌患者和835例正常對(duì)照的cfDNA樣本，作者構(gòu)建了一個(gè)在診斷方面具有特異性和高度敏感性(P<0.001)的診斷預(yù)測(cè)模型，該模型與腫瘤負(fù)荷、治療反應(yīng)和分期高度相關(guān)。此外，作者還建立了預(yù)后預(yù)測(cè)模型，有效地預(yù)測(cè)了患者的預(yù)后和生存期(P<0.001)。這些發(fā)現(xiàn)共同證明了ctDNA甲基化標(biāo)記物在肝癌的診斷、監(jiān)測(cè)和預(yù)后中的作用。

隊(duì)列：
為了研究肝細(xì)胞癌的ctDNA，作者采集了中國(guó)肝細(xì)胞癌患者和隨機(jī)選擇的健康對(duì)照者的血漿樣本，得到了715名肝癌患者和560名正常健康對(duì)照的訓(xùn)練隊(duì)列，以及383名肝癌患者和275名健康對(duì)照的驗(yàn)證隊(duì)列。

結(jié)果：
ctDNA在血液中的含量極微，每毫升血中僅有約20ng，并且混雜在更大量的正常游離DNA中，在這么微量的ctDNA中檢測(cè)單個(gè)堿基的甲基化水平具有很大的挑戰(zhàn)。

作者首先從全基因組水平上對(duì)肝癌組織和正常血液DNA的485，000個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平進(jìn)行了比較，篩選出差異性最顯著的位點(diǎn)；設(shè)計(jì)相應(yīng)的鎖式探針(Padlock probe)，對(duì)近兩千例肝癌和正常人血漿中提取的微量ctDNA進(jìn)行了甲基化PCR擴(kuò)增和測(cè)序（探針捕獲靶向甲基化測(cè)序）；確定了這些位點(diǎn)的甲基化水平后，進(jìn)而通過(guò)大量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和計(jì)算，并利用多種人工智能模擬的機(jī)器學(xué)習(xí)方法，最后分別篩選出10個(gè)和8個(gè)位點(diǎn)建立了診斷模型和生存預(yù)后模型（圖1)。
 

圖1.數(shù)據(jù)生成和分析流程圖

該診斷模型在訓(xùn)練隊(duì)列715例肝癌患者和560例正常人中的診斷敏感性和特異性分別達(dá)到了85.7%和94.3%（圖2a），在驗(yàn)證隊(duì)列383例肝癌患者和275例正常人中的診斷敏感性和特異性分別達(dá)到了83.3%和90.5%（圖2b）。作者還證明了這個(gè)模型可以將肝癌與正常對(duì)照區(qū)分開來(lái)(圖2c、d)，此外，這10個(gè)標(biāo)記物的無(wú)監(jiān)督分級(jí)聚類能夠以高度的特異性和敏感度將HCC與正常對(duì)照區(qū)分開來(lái)(圖2e，f)。
   
此外，該模型還能準(zhǔn)確的反映肝癌患者的TNM分期、體內(nèi)有無(wú)腫瘤殘留、對(duì)治療的反應(yīng)以及有無(wú)復(fù)發(fā)等（圖3）。
   
而對(duì)1049例生存資料完整的肝癌患者，依據(jù)生存預(yù)后模型進(jìn)行評(píng)分，低風(fēng)險(xiǎn)組患者的預(yù)后顯著優(yōu)于高風(fēng)險(xiǎn)組患者（圖4），顯示出利用該模型可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)肝癌患者的預(yù)后，有利于對(duì)不同的風(fēng)險(xiǎn)的患者進(jìn)行更為個(gè)體化的治療。
   
02 腫瘤溯源

標(biāo)題：Identification of methylation haplotype blocks aids in deconvolution of heterogeneous tissue samples and tumor tissue-of-origin mapping from plasma DNA.（甲基化單倍型鑒定有助于異質(zhì)組織樣本的去卷積以及根據(jù)血漿DNA的對(duì)腫瘤溯源）

期刊：Nature genetics

2021影響因子: 38.33

發(fā)表時(shí)間：2017.4

摘要：
哺乳動(dòng)物基因組中相鄰的CpG位點(diǎn)可以由于甲基轉(zhuǎn)移酶或去甲基酶的加工性而共享相似的甲基化狀態(tài)，而DNA甲基化是細(xì)胞類型特異性的，并且該模式可以用于分析異源樣品的相對(duì)細(xì)胞組成，因此共甲基化的CpG可以作為一組基因組特征用于標(biāo)記組織的來(lái)源。作者對(duì)人體全基因組中表現(xiàn)出高度一致得甲基化區(qū)域進(jìn)行系統(tǒng)性調(diào)查，使用61組全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序(WGBS)數(shù)據(jù)定義了147,888個(gè)緊密耦合的CpG位點(diǎn)，稱為甲基化單倍型(MHBs)，并用101組簡(jiǎn)化代表性亞硫酸氫鹽測(cè)序(RRBS)數(shù)據(jù)和637組甲基化芯片數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一點(diǎn)。還使用一種稱為甲基化單倍型負(fù)荷(MHL)的指標(biāo)，作者在區(qū)塊（blocks）水平上進(jìn)行了組織特異性甲基化分析。最后，作者使用甲基化單倍型對(duì)59例癌癥患者的無(wú)細(xì)胞循環(huán)DNA中的腫瘤負(fù)荷和組織起源進(jìn)行了定量估計(jì)。

方法：
作者首先通過(guò)61 組WGBS數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了MHB(甲基化單倍型區(qū)塊)，接著利用101 組RRBS數(shù)據(jù)和637組甲基化芯片數(shù)據(jù)對(duì)MHB進(jìn)行驗(yàn)證。建立甲基化單倍型負(fù)荷（MHL）模型，進(jìn)行組織特異性MHB分析，最后使用29個(gè)WGBS數(shù)據(jù)和14個(gè)RRBS數(shù)據(jù)以及59個(gè)RRBS數(shù)據(jù)（癌癥患者血清）；10個(gè)RRBS數(shù)據(jù)（和血清配對(duì)的腫瘤組織）；75個(gè)RRBS數(shù)據(jù)（對(duì)照血清）對(duì)模型進(jìn)行訓(xùn)練和測(cè)試（圖1）。
 

結(jié)果：
由61組WGBS數(shù)據(jù)建立的MHBs代表了一種獨(dú)特的基因組特征，它與多個(gè)已知的基因組元件部分重疊(圖2)。在所有MHBs中，60828個(gè)(41.1%)位于基因間隔區(qū)，87060個(gè)(58.9%)位于轉(zhuǎn)錄區(qū)。這些MHBs在增強(qiáng)子、超級(jí)增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、CpG島和印記基因上顯著富集(P<1.0×10−6)。
   
 
為了能夠?qū)υS多樣本中單個(gè)MHBs中的甲基化模式進(jìn)行定量分析，作者需要一個(gè)單一的度量來(lái)定義每個(gè)區(qū)塊中多個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化模式。理想情況下，這一指標(biāo)不僅是區(qū)塊中所有CpG位點(diǎn)的平均甲基化水平的函數(shù)，而且還可以捕捉單個(gè)DNA分子上的共甲基化模式。因此，作者定義了甲基化單倍型負(fù)荷(MHL)，對(duì)比其他定量方法，NHL表現(xiàn)出更好的MHB區(qū)分能力（圖3）。
   
作者發(fā)現(xiàn)組織特異性MHL在癌癥患者血漿中存在，但在正常血漿或全血中無(wú)法檢測(cè)到，因此組織特異性MHL在相應(yīng)的組織和癌癥血漿中可見，這表明組織起源標(biāo)測(cè)的可行性（圖4a）。接著，作者在基于10個(gè)人類正常組織的WGBS和RRBS數(shù)據(jù)集中，篩選出具有組織特異性的MHB（圖4b），將預(yù)測(cè)模型應(yīng)用于來(lái)自癌癥患者和正常個(gè)體的血漿樣品,預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性平均達(dá)到82.8%, 88.5%, 91.2%（分別是CCP,LCP和NCP樣本）（圖4c）。  
這項(xiàng)研究表明，血漿中的ctDNA甲基化單倍型分型可能是是一種用于早期檢測(cè)腫瘤及其主要生長(zhǎng)部位，以及連續(xù)監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展和多器官轉(zhuǎn)移的有效指標(biāo)。
 

03 泛癌種診斷和預(yù)后

標(biāo)題：DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of common cancers（DNA甲基化標(biāo)志物在常見癌癥診斷和預(yù)后中的應(yīng)用）

期刊：Proc Natl Acad Sci U S A.

2021影響因子: 11.205

發(fā)表時(shí)間：2017.5

摘要：
使用微創(chuàng)活檢識(shí)別特定癌癥對(duì)于改善癌癥的診斷、治療選擇和預(yù)后預(yù)測(cè)有著很大的幫助。利用來(lái)自癌癥基因組圖譜(TCGA)的全基因組甲基化數(shù)據(jù)和機(jī)器學(xué)習(xí)方法，作者評(píng)估了DNA甲基化在區(qū)分四種常見癌癥(乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌和肺癌)腫瘤組織和正常組織中的有效性。作者在1,619個(gè)腫瘤樣本和173個(gè)鄰近正常組織樣本的訓(xùn)練隊(duì)列中確定了癌癥標(biāo)記物。作者的發(fā)現(xiàn)在一個(gè)單獨(dú)的TCGA隊(duì)列中得到了驗(yàn)證，DNA甲基化分析可以預(yù)測(cè)癌癥和正常組織，準(zhǔn)確率超過(guò)95%，同時(shí)也準(zhǔn)確地將30個(gè)轉(zhuǎn)移到肝臟的結(jié)直腸癌中的29個(gè)和34個(gè)轉(zhuǎn)移到肺的結(jié)直腸癌中的32個(gè)確定下來(lái)。作者發(fā)現(xiàn)這種檢測(cè)方法還可以預(yù)測(cè)患者的預(yù)后和存活率。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)證明了甲基化生物標(biāo)記物對(duì)描述癌癥分子特征的作用，并對(duì)診斷和預(yù)后有一定的意義。

結(jié)果：
與不同癌癥類型的甲基化情況相關(guān)的無(wú)監(jiān)督等級(jí)聚類和熱圖顯示，甲基化圖譜能夠識(shí)別癌癥特異性甲基化特征。ROC曲線表明，對(duì)不同腫瘤類型的預(yù)測(cè)具有較高的敏感性和特異性，因此甲基化特征可以區(qū)分不同的癌癥類型和相應(yīng)的正常組織（圖1）。
 

 
由于識(shí)別起源組織對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移患者選擇最佳的治療策略是至關(guān)重要的，因此除了原發(fā)腫瘤外，作者還分析了30例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移和34例結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移病例。研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)監(jiān)督分級(jí)聚類可以將這些轉(zhuǎn)移與結(jié)腸癌或正常組織區(qū)分開來(lái)(圖2)。
   
接下來(lái)，作者評(píng)估了甲基化標(biāo)記對(duì)每種癌癥的預(yù)后效果。該模型在Kaplan-Meier分析中區(qū)分低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組以及具有顯著P值的相關(guān)對(duì)數(shù)等級(jí)檢驗(yàn)中表現(xiàn)良好，表明甲基化標(biāo)簽在一定程度上可以預(yù)測(cè)BRCA和LUAD的預(yù)后。

鑒于DNA甲基化是基因表達(dá)的重要表觀遺傳調(diào)節(jié)因子，作者研究了癌癥和正常組織中基因位點(diǎn)的差異甲基化是如何與基因表達(dá)相關(guān)的。作者觀察到啟動(dòng)子甲基化和基因表達(dá)之間的負(fù)相關(guān)，并確定了幾個(gè)已知在癌癥發(fā)生中起重要作用的基因，以及在LIHC中功能相對(duì)未知的基因。在表達(dá)降低的高甲基化基因中，作者選擇了一個(gè)LIHC的相關(guān)基因FUZ，F(xiàn)UZ的過(guò)表達(dá)抑制了LIHC細(xì)胞系的生長(zhǎng)(圖3)，這說(shuō)明癌癥甲基化特征與其基因表達(dá)模式和功能相關(guān)。  
作者認(rèn)為，DNA甲基化可以通過(guò)更準(zhǔn)確的診斷來(lái)幫助患者改善預(yù)后，特別是相對(duì)惰性或者侵襲性腫瘤。雖然在本文中只選取了4種常見癌癥，但是作者認(rèn)為，DNA甲基化檢測(cè)可以應(yīng)用于更多不同種類的癌癥診療中，其最大的優(yōu)勢(shì)在于只需要少量的組織獲得足夠的DNA就可以完成檢測(cè)。
 
參考文獻(xiàn)：
https://www.nature.com/articles/nmat4997
https://www.nature.com/articles/ng.3805
https://www.pnas.org/content/114/28/7414