MeRIP-seq揭示衰老和神經變性過程中m6A RNA甲基化修飾的保守下調機制
2023年02月22日，《美國國家科學院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA)期刊發(fā)表了題為“Conserved reduction of m6A RNA modifications during aging and neurodegeneration is linked to changes in synaptic transcripts”的研究論文，該研究通過對小鼠和人的健康腦組織和AD（阿爾茨海默病，Alzheimer’s disease）患病腦組織進行MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR等實驗，揭示m6A修飾減少與突觸蛋白合成受損相關。
標題：Conserved reduction of m6A RNA modifications during aging and neurodegeneration is linked to changes in synaptic transcripts（衰老和神經變性過程中m6A RNA修飾減少與突觸轉錄本變化相關）
時間：2023.02.22
期刊：Proc Natl Acad Sci USA
影響因子：IF 12.779
技術平臺：MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR、Polysome-seq、H3K36me3 ChIP-seq等
樣本實驗：
研究摘要：
N6-甲基腺苷（m6A）調控mRNA代謝。盡管已有研究表明m6A修飾與哺乳動物大腦的發(fā)育和認知相關，但m6A在突觸可塑性中（尤其是在認知衰退期間）的作用尚未完全了解。本研究采用甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）繪制了年輕（young）和老年（aged）小鼠海馬亞區(qū)CA1、CA3和齒狀回以及前扣帶皮層（anterior cingulate cortex，ACC）的m6A表觀轉錄組圖譜，結果表明老年小鼠的m6A水平降低。對認知完整的健康人類和阿爾茨海默�。ˋD）患者的扣帶皮層（CC）腦組織的MeRIP-seq比較分析顯示，AD患者中m6A RNA甲基化水平降低。在與突觸功能相關的轉錄本中發(fā)現(xiàn)老年小鼠和AD患者大腦常見的m6A變化，包括鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶2（CAMKII）和AMPA選擇性谷氨酸受體1（Glua1），鄰近連接試驗表明，m6A水平降低導致突觸蛋白合成（如CAMKII和GLUA1）減少。此外m6A水平降低還會導致突觸功能受損。本研究結果表明，m6A RNA甲基化調控突觸蛋白合成，并可能在與衰老和AD相關的認知衰退中發(fā)揮作用。
研究意義：
本研究描述了小鼠和人類的健康和AD患病大腦中的全基因組m6A表觀轉錄組圖譜。數(shù)據分析表明，大量的m6A轉錄本保守，且這些轉錄本集中在突觸處富集、與突觸過程的調控有關。研究人員在AD小鼠模型的腦組織和患有阿爾茨海默病患者的扣帶回腦組織中檢測到m6A RNA甲基化水平降低。本研究在機制水平上證明了m6A修飾減少與受損的突觸蛋白合成相關。
結果圖形
（1）成年小鼠大腦中的m6A圖譜
本研究通過表征健康成年小鼠大腦中m6A RNA修飾圖譜來開始分析。提取并解剖了十只（C57BL/6J）3月齡（young）野生型（WT）小鼠的大腦，以獲得海馬亞區(qū)CA1、CA3和齒狀回（DG）以及前扣帶皮層（ACC），實驗所用樣本與學習和記憶過程以及認知疾病有關。對樣本進行甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）以鑒定年輕成年小鼠的亞區(qū)域特異性表觀轉錄組圖譜。
圖1：成年小鼠大腦的m6A RNA甲基化圖譜。
這些數(shù)據表明常見的m6A轉錄本可能在突觸處特異性富集，為了進一步深入研究，作者利用最近發(fā)表的包含高可信度的海馬突觸RNAome數(shù)據集，并將其與海馬表觀轉錄組數(shù)據進行比較分析。在這兩個數(shù)據集中觀察到突觸在mRNA中甲基化轉錄本中的強富集，超過70%的突觸體和64%的微流體室轉錄組中至少有一個m6A peaks。基于本研究數(shù)據列表與其他數(shù)據庫的交叉比較分析，表明m6A RNA修飾是成年大腦突觸功能的關鍵調控過程。
（2）成年人腦中的m6A甲基化修飾揭示了與突觸功能相關的轉錄本保守富集
接下來，作者對5個死后認知未衰退健康人腦的扣帶皮層（CC）組織進行MeRIP-seq，以描繪人腦轉錄本中的m6A分布。
（3）小鼠認知衰退模型和人類AD患者腦組織中的m6A RNA變化
通過MeRIP-seq數(shù)據證明了通過m6A修飾調控突觸組織、功能和可塑性可能是成年哺乳動物大腦中的保守機制。為了進一步探索這一點，作者選擇鼠年齡相關記憶障礙作為認知衰退模型系統(tǒng)研究了m6A修飾變化機制。
圖4：表觀轉錄組學在神經變性和衰老中的變化。
（4）m6A水平降低影響可塑相關蛋白CAMKII的合成
本研究通過MeRIP-seq等實驗闡明了m6A RNA修飾在年輕和老年小鼠大腦以及認知完整的人類和AD患者大腦中的功能，為該領域的進一步研究提供了重要資源。由于在大腦衰老和AD中觀察到突觸基因的m6A RNA甲基化降低，因此靶向m6A RNA甲基化機制可能是預防認知衰退的頗具前景的策略。
參考文獻：
Castro-Hernández R,et al. Conserved reduction of m6A RNA modifications during aging and neurodegeneration is linked to changes in synaptic transcripts. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023 Feb 28;120(9):e2204933120.
時間：2023.02.22
期刊：Proc Natl Acad Sci USA
影響因子：IF 12.779
技術平臺：MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR、Polysome-seq、H3K36me3 ChIP-seq等
樣本實驗：
研究摘要：
N6-甲基腺苷（m6A）調控mRNA代謝。盡管已有研究表明m6A修飾與哺乳動物大腦的發(fā)育和認知相關，但m6A在突觸可塑性中（尤其是在認知衰退期間）的作用尚未完全了解。本研究采用甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）繪制了年輕（young）和老年（aged）小鼠海馬亞區(qū)CA1、CA3和齒狀回以及前扣帶皮層（anterior cingulate cortex，ACC）的m6A表觀轉錄組圖譜，結果表明老年小鼠的m6A水平降低。對認知完整的健康人類和阿爾茨海默�。ˋD）患者的扣帶皮層（CC）腦組織的MeRIP-seq比較分析顯示，AD患者中m6A RNA甲基化水平降低。在與突觸功能相關的轉錄本中發(fā)現(xiàn)老年小鼠和AD患者大腦常見的m6A變化，包括鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶2（CAMKII）和AMPA選擇性谷氨酸受體1（Glua1），鄰近連接試驗表明，m6A水平降低導致突觸蛋白合成（如CAMKII和GLUA1）減少。此外m6A水平降低還會導致突觸功能受損。本研究結果表明，m6A RNA甲基化調控突觸蛋白合成，并可能在與衰老和AD相關的認知衰退中發(fā)揮作用。
研究意義：
本研究描述了小鼠和人類的健康和AD患病大腦中的全基因組m6A表觀轉錄組圖譜。數(shù)據分析表明，大量的m6A轉錄本保守，且這些轉錄本集中在突觸處富集、與突觸過程的調控有關。研究人員在AD小鼠模型的腦組織和患有阿爾茨海默病患者的扣帶回腦組織中檢測到m6A RNA甲基化水平降低。本研究在機制水平上證明了m6A修飾減少與受損的突觸蛋白合成相關。
結果圖形
（1）成年小鼠大腦中的m6A圖譜
本研究通過表征健康成年小鼠大腦中m6A RNA修飾圖譜來開始分析。提取并解剖了十只（C57BL/6J）3月齡（young）野生型（WT）小鼠的大腦，以獲得海馬亞區(qū)CA1、CA3和齒狀回（DG）以及前扣帶皮層（ACC），實驗所用樣本與學習和記憶過程以及認知疾病有關。對樣本進行甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）以鑒定年輕成年小鼠的亞區(qū)域特異性表觀轉錄組圖譜。
圖1：成年小鼠大腦的m6A RNA甲基化圖譜。
- 實驗方案。
- 上：根據input計算海馬CA1、CA3和DG區(qū)域中m6A甲基化轉錄本百分比餅圖。下：注釋的轉錄區(qū)域的m6A peaks位點。百分比由m6A peaks總數(shù)計算。
- 海馬亞區(qū)mRNA上m6A peaks分布吉他圖。
- 海馬亞區(qū)m6A甲基化轉錄本Venn圖。
- 所有海馬區(qū)域中檢測到的m6A甲基化轉錄本GO富集分析
- 上：在ACC轉錄組中m6A RNA甲基化的分布。下：注釋的轉錄本區(qū)域的m6A peaks位點。
- ACC中mRNA的m6A peaks分布吉他圖
- 比較海馬和ACC中m6A常見甲基化轉錄本Venn圖。
- 海馬和ACC中常見m6A甲基化轉錄本中突觸特異性GO富集分析Sunburst圖。
- 從海馬突觸體或從微流體室（microfluid chamber）中分離突觸中獲得的RNA-seq數(shù)據集中m6A甲基化轉錄本百分比餅圖。ACC-前扣帶皮層，DG-齒狀回，5‘UTR-5'非翻譯區(qū)，3’UTR-3'非翻譯區(qū)，CDS-編碼序列，ncRNA-非編碼RNA。
這些數(shù)據表明常見的m6A轉錄本可能在突觸處特異性富集，為了進一步深入研究，作者利用最近發(fā)表的包含高可信度的海馬突觸RNAome數(shù)據集，并將其與海馬表觀轉錄組數(shù)據進行比較分析。在這兩個數(shù)據集中觀察到突觸在mRNA中甲基化轉錄本中的強富集，超過70%的突觸體和64%的微流體室轉錄組中至少有一個m6A peaks。基于本研究數(shù)據列表與其他數(shù)據庫的交叉比較分析，表明m6A RNA修飾是成年大腦突觸功能的關鍵調控過程。
（2）成年人腦中的m6A甲基化修飾揭示了與突觸功能相關的轉錄本保守富集
接下來，作者對5個死后認知未衰退健康人腦的扣帶皮層（CC）組織進行MeRIP-seq，以描繪人腦轉錄本中的m6A分布。
圖2：小鼠和人之間保守的m6A修飾。
- 上：根據input計算人CC中m6A甲基化轉錄本百分比餅圖。下圖：注釋的轉錄區(qū)域m6A peaks位點。
- 人CC中mRNA上m6A修飾分布吉他圖
- m6A peaks的motif分析鑒定出m6A DRACH共有motif（D=A、T或G，R=A或G，H=A、T或C）。
- 左：分別在人/小鼠中已知同源物的小鼠/人基因Doughnut圖，用于比較不同物種的甲基化轉錄本。右：比較成年小鼠ACC和人CC中m6A甲基化同源轉錄本的Venn圖。
- 小鼠ACC和人CC共有m6A甲基化轉錄本的GO分析（生物學過程）。
- 小鼠ACC和人CC共有m6A甲基化轉錄本GO富集分析的突觸特異性Sunburst圖。
- 在小鼠ACC和人CC（CAMKIIb/CAMKIIb）中的Camk2b沿同源轉錄本3'端保守的m6A修飾代表性覆蓋軌跡。軌跡根據相應input和文庫大小歸一化的m6A RIP覆蓋值。以RPM為單位刻度。
- 人CC特異性m6A甲基化轉錄本的GO分析。
- 與突觸RNA相比，保守轉錄本（通常在小鼠和人類中檢測到）與人和小鼠特異性轉錄本之間相關聯(lián)的優(yōu)勢比熱圖。
（3）小鼠認知衰退模型和人類AD患者腦組織中的m6A RNA變化
通過MeRIP-seq數(shù)據證明了通過m6A修飾調控突觸組織、功能和可塑性可能是成年哺乳動物大腦中的保守機制。為了進一步探索這一點，作者選擇鼠年齡相關記憶障礙作為認知衰退模型系統(tǒng)研究了m6A修飾變化機制。
圖3：老年小鼠大腦中的組織特異性m6A變化
- 實驗方案。
- 在相應的腦亞區(qū)中檢測到的差異表達和差異甲基化基因數(shù)量條形圖，對FC和調整后的P值應用相同的截止值（FC>1.2，padj≤0.05）。
- 在分析的大腦亞區(qū)中m6A甲基化轉錄本百分比餅圖，其中包含在衰老過程中僅甲基化水平降低（低甲基化）和僅甲基化水平增加（高甲基化）的peaks，或m6A peaks減少和增加（混合）的混合peaks。
- 所研究大腦區(qū)域轉錄本中顯著低甲基化m6A peaks的注釋分布條形圖。
- 比較海馬亞區(qū)和ACC的低甲基化轉錄本Venn圖。深紅色矩形表示在所有海馬亞區(qū)檢測到的87個轉錄本。相應的右/上圖顯示了這些轉錄本的GO富集分析（生物過程）。黑色矩形表示海馬和ACC中通常低甲基化的33個轉錄本，右/下圖顯示了相應的GO富集分析。
- 兩個差異甲基化基因（低甲基化和高甲基化）的qPCR驗證。圖中顯示了MeRIP-seq和MeRIP–qPCR檢測到的甲基化FC。MeRIP-seq數(shù)據列表顯示了FDR的平均FC，由ExomePeak計算。MeRIP-qPCR數(shù)據列表顯示了每個條件四個獨立重復的平均值±SEM。統(tǒng)計顯著性由Student's t檢驗確定，P值顯示在比較值上方。
圖4：表觀轉錄組學在神經變性和衰老中的變化。
- AD組與對照組樣品中差異表達和差異m6A甲基化轉錄本數(shù)量條形圖，對FC和調整后的P值應用相同的截止值（FC>1.2，padj≤0.05）。
- 與對照組相比，AD樣本中低甲基化、高甲基化和混合轉錄本的比例餅圖。
- 與對照組相比，AD中m6A低甲基化轉錄本（FC>1.5）的GO富集分析。
- AD中低甲基化轉錄本m6A peaks分布條形圖。
- 比較老年小鼠ACC和人AD患者CC中顯著低甲基化轉錄本Venn圖，突出顯示的是CaMKII亞型。
- KEGG通路LTP圖（hsa04720）。紫色突出顯示的是AD患者的老年小鼠ACC和人CC中通常低甲基化的轉錄本。CAMKII也屬于該組，但由于其低甲基化通過qPCR（H）驗證，因此以紅色突出顯示。
- 在年輕與老年小鼠、健康對照與AD患者中的人CC大腦中CamkII亞型的m6A低甲基化條形圖。每條代表最接近終止密碼子的相應轉錄本的3‘UTR中的甲基化位點。
- qPCR驗證不同CamkII亞型的3‘UTR中低甲基化區(qū)域。圖中顯示通過MeRIP-seq和MeRIP-qPCR檢測的m6A甲基化中的FC。誤差條顯示6/4（young/aged）獨立重復的平均值±SEM；P值顯示在比較上方。統(tǒng)計顯著性通過Student's t檢驗和Welch對不等方差的校正進行評估。
（4）m6A水平降低影響可塑相關蛋白CAMKII的合成
圖5：m6A水平變化影響CAMKII突觸蛋白合成
- 用靶向Mettl3（Mettl3 KD）或相應對照寡核苷酸（對照）的GAPmer處理神經元培養(yǎng)物中Mettl3表達的qPCR結果條形圖。
- 代表性的immunoblot分析顯示METTL3蛋白水平響應于GAPmer介導的METTL3敲除。
- B的量化。
- GAPmer介導的Mettl3敲除后的主要m6A水平。A、C和D中的圖表顯示了每個條件的平均值±SEM。每個數(shù)據點代表一個獨立的復制。
- 用于量化原代神經元中CAMKII合成的puro-PLA標記示意圖。
- 用對照或Mettl3 KD GAPmers處理的原代海馬神經元的代表性圖像。（比例尺，20μm）CAMKII-PLA信號顯示為綠色，SYP顯示為紅色，Map2顯示為藍色。右圖顯示了代表性樹突的高倍圖像（比例尺，10μm）。箭頭表示突觸附近的CAMKII合成位點。
- 處理的神經元中檢測到的PLA點總數(shù)的Violin圖。陰性對照（NegC）在PLA前未經嘌呤霉素處理。
- 比較對照和Mettl3 KD處理的神經元中突觸定位的CAMKII-PLA點的Violin圖。G和H中的圖顯示三個獨立實驗的平均值；每個實驗對7-13個神經元進行成像和分析。四分位數(shù)用灰線標記。
- 微流體室中生長的原代神經元突觸室中歸一化CAMKIIa mRNA水平。I中的點代表神經元培養(yǎng)體的獨立重復。
本研究通過MeRIP-seq等實驗闡明了m6A RNA修飾在年輕和老年小鼠大腦以及認知完整的人類和AD患者大腦中的功能，為該領域的進一步研究提供了重要資源。由于在大腦衰老和AD中觀察到突觸基因的m6A RNA甲基化降低，因此靶向m6A RNA甲基化機制可能是預防認知衰退的頗具前景的策略。
參考文獻：
Castro-Hernández R,et al. Conserved reduction of m6A RNA modifications during aging and neurodegeneration is linked to changes in synaptic transcripts. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023 Feb 28;120(9):e2204933120.
