體外血管生成三維培養(yǎng)模型構(gòu)建應(yīng)用指南

以下實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果皆來源于TheWell實(shí)驗(yàn)室。

我們使用即用型VitroGel Angiogenesis Assay Kit和高濃度VitroGel Angiogenesis Assay HC Kit來證明水凝膠特性修飾對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）血管生成檢測(cè)的影響。

實(shí)驗(yàn)從2D水凝膠包被培養(yǎng)方法開始，其中我們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)板底部從VitroGel AAK制備了一層厚厚的水凝膠，并將HUVEC細(xì)胞接種在水凝膠層的頂部。HUVEC血管生成對(duì)不同的水凝膠組成（血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）陽性，VEGF陰性或無生長因子）表現(xiàn)出顯著差異，即使使用相同的內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基，也顯示不同的管腔結(jié)構(gòu)和血管形成。另一方面，我們能夠通過使用VitroGel AAK-HC來調(diào)節(jié)水凝膠濃度。數(shù)據(jù)表明，除了基質(zhì)內(nèi)的生長因子外，機(jī)械性能還會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞活力和管形成 - 由于依賴于天然ECM的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)的限制，這種影響以前是未知的。當(dāng)HUVEC被包裹在水凝膠中時(shí)，同樣的觀察結(jié)果可以進(jìn)一步擴(kuò)展到3D細(xì)胞培養(yǎng)。

結(jié)果顯示水凝膠的可調(diào)節(jié)性和機(jī)械強(qiáng)度以及使用VitroGel水凝膠的最佳濃度，培養(yǎng)時(shí)間和3D血管結(jié)構(gòu)形成的影響。我們證明生長因子不僅存在于培養(yǎng)基中，而且存在于水凝膠本身中，顯著影響管的形成。用無異源可調(diào)節(jié)的VitroGel水凝膠系統(tǒng)代替天然ECM，研究人員能夠研究微環(huán)境的物理、化學(xué)、生物學(xué)特性與細(xì)胞行為之間的關(guān)系。

簡(jiǎn)而言之，兩種體外水凝膠血管生成試劑盒是研究人員探索血管生成的強(qiáng)大工具。我們希望這些試劑盒能助力研究人員和研究團(tuán)隊(duì)建立復(fù)雜的組織模型，以提升藥物篩選過程、細(xì)胞侵襲測(cè)定以及內(nèi)皮細(xì)胞和血管生成的疾病相關(guān)研究。

材料和方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）維持在含有10%胎牛血清（FBS）和1x青霉素-鏈霉素抗生素的內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基（EGM）中。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80-90%融合率時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。
 

二、調(diào)節(jié)水凝膠性能

✦ 01、研究水凝膠中生長因子對(duì)血管生成的影響
為了研究水凝膠內(nèi)生長因子對(duì)細(xì)胞生長和血管生成的影響，將HUVEC與即用型VitroGel AAK試劑盒一起使用。兩種類型的VitroGel AAK添加物可用于直接與VitroGel AAK混合。VitroGel AAK Supplement 1（不含VEGF）用于制備VEGF陰性水凝膠，VitroGel AAK Supplement 2（含VEGF）用于制備VEGF陽性水凝膠。為了制備不含額外生長因子的水凝膠，我們使用VitroGel AAK水凝膠直接與EGM基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合（請(qǐng)閱讀VitroGel AAK試劑盒的操作說明書以了解詳細(xì)的水凝膠制備）。

✦ 02、研究水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度對(duì)血管生成的影響
使用高濃度VitroGel AAK-HC試劑盒調(diào)節(jié)水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度。將VitroGel AAK-HC水凝膠與VitroGel AAK稀釋溶液分別以1:0、1:1和1:3（v/v）的比例混合。然后將稀釋的水凝膠混合物與VitroGel AAK添加物混合，以根據(jù)以下方法說明制備2D水凝膠包被培養(yǎng)物或3D培養(yǎng)物（請(qǐng)閱讀VitroGel AAK-HC試劑盒的操作說明書以了解詳細(xì)的水凝膠制備）。
 

三、2D水凝膠包被培養(yǎng)

✦ 01、將 1 mL 水凝膠溶液加入 500 μL AAK Supplement 1 中，輕輕上下顛倒 5-10 次以充分混勻。

注意：保持VitroGel AAK溶液和AAK Supplement 1的混合比例為2：1（v / v）。

✦ 02、將 50 μL 水凝膠混合物轉(zhuǎn)移到 96 孔板中。輕輕旋轉(zhuǎn)孔板以確保均勻覆蓋孔底部。

✦ 03、室溫下靜置10-15分鐘以形成軟凝膠。

注意：在此期間，不要搖晃孔板干擾軟凝膠的形成。

✦ 04、小心地將 50 μL 細(xì)胞懸液添加到凝膠頂部。在 37°C 下孵育。

✦ 05、將細(xì)胞在37°C孵育，每隔一天更換50-80%的頂部培養(yǎng)基。

四、3D培養(yǎng)

對(duì)于HUVEC的3D培養(yǎng)，使用VitroGel AAK和VitroGel AAK-HC觀察血管的形成和結(jié)構(gòu)。使用以下步驟制備水凝膠-細(xì)胞混合物（以AAK Supplement 1為例）：

✦ 01、在AAK Supplement 1中制備細(xì)胞懸液。推薦的細(xì)胞濃度為 1-2 x10⁶細(xì)胞/mL。

✦ 02、將 1 mL 水凝膠溶液添加到上一步的 500 μL 細(xì)胞懸液中。輕輕上下顛倒 5-10 次以徹底混勻，將水凝膠和細(xì)胞懸液保持在 2：1 （v/v） 的比例。

✦ 03、將 50 μL 水凝膠混合物轉(zhuǎn)移到 96 孔板中。輕輕旋轉(zhuǎn)孔板以確保均勻覆蓋每個(gè)孔的表面。

✦ 04、室溫下靜置10-15分鐘以形成軟凝膠。

注意：在此期間，不要搖晃孔板干擾軟凝膠的形成。

✦ 05、小心地在孔頂部添加 50 μL 額外培養(yǎng)基以覆蓋水凝膠。

✦ 06、置于37°C的培養(yǎng)箱中孵育，每隔一天更換50-80%的頂部培養(yǎng)基，以免影響培養(yǎng)板中的水凝膠狀態(tài)（或根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更換覆蓋培養(yǎng)基）。

五、熒光成像

 

對(duì)于熒光成像，將細(xì)胞固定并用Actin Green和NucBlue染色，以標(biāo)記F-actin以及細(xì)胞核。 詳細(xì)步驟如下：

 

✦ 01、用移液管小心地移除水凝膠頂部的培養(yǎng)基。
✦ 02、水凝膠用100 μL DPBS洗滌。將洗滌緩沖液留在水凝膠上1分鐘，然后移除。
✦ 03、將100 μL細(xì)胞固定溶液（4%甲醛）加入到水凝膠表面。
✦ 04、孔板置于室溫下孵育15-30分鐘，然后移除固定液。
✦ 05、用 100 μL DPBS 輕輕洗滌水凝膠 3 次，使洗滌緩沖液在兩次洗滌之間靜置1分鐘。
✦ 06、加入 100 μL 0.1% Triton X-100），并在室溫下孵育 5 分鐘。
✦ 07、小心地移除Triton X-100，用100 μL DPBS洗滌孔三次，使洗滌緩沖液在兩次洗滌之間靜置1分鐘。
✦ 08、向水凝膠中加入 100 μL 封閉液（3% BSA的DPBS溶液），并在室溫下孵育 60 分鐘。
✦ 09、去除封閉液，添加ActinGreen 488或DRAQ5 ReadyProbes 試劑（ThermoFisher，按照操作說明添加）。
✦ 10、將孔板孵育30分鐘，然后加入NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes試劑（ThermoFisher）。
✦ 11、孔板避光孵育5分鐘并進(jìn)行熒光成像。

 

六、結(jié)果和討論
 

在水凝膠表面培養(yǎng)HUVEC。圖1顯示了接種到含有VEGF陽性AAK Supplement 2 中培養(yǎng)18小時(shí)的HUVEC血管生成的圖像，VitroGel AAK （左圖）、AAK-HC水凝膠（右圖）。

圖1. VitroGel AAK水凝膠頂部?jī)?nèi)皮細(xì)胞的血管生成

 

✦ 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 （HUVEC） 接種在（左圖）VitroGel AAK 水凝膠或（右圖）VitroGel AAK-HC 水凝膠與 AAK Supplement 2中培養(yǎng)18小時(shí)后血管生成的圖像。

✦ 熒光顯微鏡觀察以可視化VitroGel AAK或VitroGel AAK-HC水凝膠上的HUVEC活性和血管生成。圖2顯示了肌動(dòng)蛋白絲的免疫熒光圖像和HUVEC的核酸染色。在這里，我們觀察到大量的肌動(dòng)蛋白絲和核酸，表明水凝膠的巨大活力以及整體血管的形成和形態(tài)。

圖2. HUVEC細(xì)胞在VitroGel AAK水凝膠（A）/VitroGel AAK-HC水凝膠（B）與AAK Supplement 2上的管狀形態(tài)。將細(xì)胞固定并用DAPI（藍(lán)色）和actin green（綠色）染色。

 

✦ 當(dāng)使用VEGF陰性添加物（VitroGel AAK Supplement 1）的水凝膠時(shí)，在VitroGel AAK和VitroGel AAK-HC水凝膠的兩種情況下，HUVEC能夠在表面上附著和生長而不會(huì)形成管（圖3）。圖2和圖3表明，盡管在兩種水凝膠條件下使用了相同的完全培養(yǎng)基，但水凝膠中的VEGF生長因子會(huì)顯著影響管的形成。
 

圖3.HUVEC細(xì)胞在VitroGel AAK水凝膠（A）/VitroGel AAK-HC水凝膠（B）與AAK Supplement 1上的生長形態(tài)。將細(xì)胞固定并用DRAQ5（紅色）和actin green（綠色）染色。

 

✦ 接下來，我們旨在比較在補(bǔ)充或不補(bǔ)充生長因子的情況下制備的VitroGel AAK水凝膠上的HUVEC生長，以突出生長因子對(duì)水凝膠血管生成的影響。在該實(shí)驗(yàn)中，在水凝膠頂部使用相同的完整內(nèi)皮生長培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。在圖4的不同時(shí)間點(diǎn)獲得具有VitroGel AAK Supplement 2或不含生長因子的水凝膠頂部的HUVEC細(xì)胞生長。圖4B和4D顯示了在水凝膠表面上生長的細(xì)胞，其中不含生長因子添加物，而圖4A和4C顯示了給予VitroGel AAK-Supplement 2的細(xì)胞的圖像。

有趣的是，盡管在兩種培養(yǎng)條件下都使用了完整的細(xì)胞培養(yǎng)基，但與未從水凝膠中補(bǔ)充生長因子的細(xì)胞相比，延時(shí)視頻顯示，添加細(xì)胞生長因子后，水凝膠中的細(xì)胞附著和血管生成有顯著改善。

這些圖像為水凝膠添加物對(duì)HUVEC增殖和活力的益處提供了進(jìn)一步的證據(jù)，因?yàn)榕c接受水凝膠生長因子支持的細(xì)胞相比，沒有補(bǔ)充生長因子的細(xì)胞清楚地顯示出更少的管腔結(jié)構(gòu)（圖4D紅色箭頭）。

圖4.有和沒有生長因子添加物的VitroGel AAK水凝膠頂部?jī)?nèi)皮細(xì)胞生長的比較。左上）實(shí)時(shí)視頻顯示HUVEC接種在含有VEGF的AAK Supplement 2中培養(yǎng)18小時(shí)的血管生成圖；右上）實(shí)時(shí)視頻顯示沒有細(xì)胞生長因子的HUVEC接種；C）HUVEC細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)在具有AAK Supplement 2的VitroGel AAK水凝膠頂部生長；D）沒有細(xì)胞生長因子的不同時(shí)間點(diǎn)的HUVEC細(xì)胞生長。紅色箭頭表示管狀結(jié)構(gòu)形成。

 

✦ 對(duì)于VitroGel AAK-HC水凝膠的研究，我們旨在提供基質(zhì)的機(jī)械性能如何影響HUVEC血管生成的新方案。因此，我們制備了不同濃度的水凝膠，以實(shí)現(xiàn)水凝膠基體的各種機(jī)械強(qiáng)度。VitroGel AAK Supplement 2用于制備所有水凝膠，以消除生長因子對(duì)細(xì)胞生長的影響，以專注于機(jī)械性能的影響。這些分析的結(jié)果如圖5所示。
更強(qiáng)的水凝膠機(jī)械強(qiáng)度（即較低的稀釋比，例如1:0）導(dǎo)致血管生成減少，因?yàn)榧?xì)胞更容易聚集導(dǎo)致細(xì)胞死亡。與較軟的水凝膠混合物（如 1:1 稀釋或 1:3 稀釋）相比，1:0 稀釋比例的管結(jié)構(gòu)形成明顯減少。特別是，在血管生成后，1:0稀釋水凝膠表面上的細(xì)胞在大約12小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)開始聚集并形成細(xì)胞球狀體。在16:1稀釋的1小時(shí)時(shí)間點(diǎn)觀察到類似的觀察結(jié)果，而對(duì)于最柔軟的水凝膠（1:3稀釋），細(xì)胞能夠附著在水凝膠表面并在18小時(shí)逐漸形成管結(jié)構(gòu)。
水凝膠的理想情況應(yīng)該是它幫助細(xì)胞適應(yīng)特定物質(zhì)的能力，并最終使細(xì)胞能夠很好地?cái)U(kuò)散并附著在基質(zhì)上，最終誘導(dǎo)血管生成。總體而言，這些數(shù)據(jù)表明高機(jī)械強(qiáng)度對(duì)于管結(jié)構(gòu)的形成和血管生成特性并不是最佳的。同樣，這些數(shù)據(jù)表明，較軟的水凝膠濃度在較長時(shí)間內(nèi)為細(xì)胞附著和活力提供了更好的支持。

圖5 水凝膠機(jī)械強(qiáng)度對(duì)血管生成的影響
 

結(jié)

語

應(yīng)用中描述的數(shù)據(jù)為無異源水凝膠血管生成試劑盒 VitroGel Angiogenesis Assay Kits 作為HUVEC 細(xì)胞 2D 水凝膠包被和 3D 培養(yǎng)研究工具的實(shí)用性提供了證據(jù)。

這些數(shù)據(jù)表明，水凝膠中的生長因子（例如VEGF）會(huì)顯著影響血管的形成。同樣，水凝膠濃度本身對(duì)于生長，增殖和血管生成也很重要，因?yàn)榫哂休^高機(jī)械強(qiáng)度的水凝膠導(dǎo)致血管生成大大減少，而較軟的水凝膠促進(jìn)這種生長。

總之，水凝膠血管生成試劑盒 VitroGel Angiogenesis Assay Kits  可以精確地模擬體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞微環(huán)境，血管生成的細(xì)胞-細(xì)胞間和細(xì)胞-環(huán)境間的相互作用。我們希望這些工具可以助力研究人員探索血管生成過程的更全面的機(jī)制，以及建立組織模型，用于藥物篩選、細(xì)胞侵襲和癌癥研究等應(yīng)用。
 

 

參考文獻(xiàn)

 

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3、Stepanova, D., Byrne, H. M.,et al. (2021). A multiscale model of complex endothelial cell dynamics in early angiogenesis. PLOS Computational Biology, 17(1), e1008055.
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