HepG2細(xì)胞培養(yǎng)技巧
其廣泛應(yīng)用于遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)、外源性生物性異物的細(xì)胞毒性、乙型肝炎病毒感染機(jī)制、病毒培養(yǎng)等方面的研究。由于其與肝細(xì)胞具有相同的生物學(xué)活性，還被用于胰島素抵抗的研究。本文對(duì)肝癌細(xì)胞培養(yǎng)的最佳條件做一簡(jiǎn)單綜述。
1. HepG2細(xì)胞的復(fù)蘇條件
1.1 復(fù)蘇溫度的選擇
采用下述方法進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇：快速將所凍存細(xì)胞40℃水浴搖床60轉(zhuǎn)/ min慢搖至其溶解，溶解后馬上轉(zhuǎn)入 37 ℃水浴箱，手工慢搖恒溫 2～3min復(fù)蘇 ,復(fù)蘇后 800 轉(zhuǎn)/ min 離心 5min,吸去上清加入 10ml 含 15%胎牛血清 DMEM 培養(yǎng)基 ,混勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)板 ,每孔 1 ml，5% CO₂溫箱 37℃培養(yǎng)。上述方法與細(xì)胞專著所述方法相比較，傳統(tǒng) 37 ℃水浴方法復(fù)蘇后細(xì)胞存活率為 68.4%，先40℃溶解后37℃恒溫方法復(fù)蘇后細(xì)胞存活率為85.7%。證明其所用方法優(yōu)于傳統(tǒng)方法。1.2 復(fù)蘇用培養(yǎng)基的選擇
使用培養(yǎng)基培養(yǎng)基RPMI-1640和DMEM兩種培養(yǎng)基對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞結(jié)果在接種密度為1×10^4/c㎡、血清含量為15%時(shí)，經(jīng)6h培養(yǎng)后細(xì)胞開(kāi)始貼壁，12h后大部分細(xì)胞貼壁，且增值速度最快，4d后可以按1:3的比例傳代。而用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞在接種密度為1×10^4/c㎡、血清含量為20%時(shí)，時(shí)，經(jīng)6h培養(yǎng)后細(xì)胞貼壁不明顯，但12h后部分細(xì)胞貼壁，24h后亦大部分細(xì)胞貼壁，且增值速度相對(duì)較慢，5天后可以按1:3的比例進(jìn)行傳代。以上結(jié)果說(shuō)明，使用DMEM培養(yǎng)基既可以節(jié)省血清，細(xì)胞貼壁所用時(shí)間短、增殖速度快，并且傳代細(xì)胞培養(yǎng)也使用DMEM培養(yǎng)基，使用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇，避免了配制不同培養(yǎng)基所帶來(lái)的麻煩，因此在HepG2細(xì)胞復(fù)蘇中推薦使用DMEM培養(yǎng)基。
1.3 復(fù)蘇時(shí)的接種密度
研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)接種密度為1×10^4/c㎡，血清含量為20%時(shí), 細(xì)胞24 后大部分貼壁, 且增殖速度最快, 5d后可按1:3比例傳代；當(dāng)接種密度大于1×10^4/c㎡和（或）血清含量少于20%時(shí), 細(xì)胞表現(xiàn)為貼壁困難, 出現(xiàn)進(jìn)行性退化; 當(dāng)接種密度小于1×10^4/c㎡ 血清含量為20%時(shí), 細(xì)胞24h后大部分貼壁, 但增殖速度明顯減慢, 約7d后才可按1:3比例傳代。
2. 消化酶及消化時(shí)間的選擇研究發(fā)現(xiàn)，EDTA+胰酶的消化能力太強(qiáng)，消化時(shí)間不好把握，傳代消化后細(xì)胞死亡較多；EDTA消化能力太弱，消化時(shí)間太長(zhǎng)且不易將細(xì)胞消化完全;用PBS將細(xì)胞洗3次，再加入 0.25%胰酶，覆蓋細(xì)胞約30s后吸去胰酶，37℃放置 2～3 min，顯微鏡下可觀察到細(xì)胞消化適度。將待傳代細(xì)胞不用PBS洗滌和用pH7.2的PBS洗滌一遍、二遍、三遍后分別用0.25%的胰蛋白酶溶液、0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液進(jìn)行消化（消化液用量為蓋滿瓶底），觀察時(shí)間為30秒，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分鐘。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不用PBS洗滌的細(xì)胞分別用上述兩種酶消化，10分鐘后細(xì)胞仍然消化不完全。
用pH7.2的PBS洗滌一遍、二遍、三遍后的細(xì)胞，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化時(shí)，分別經(jīng)3分鐘、1分鐘和0.5分鐘能完全消化好細(xì)胞。而用0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液進(jìn)行消化時(shí)，完全消化好細(xì)胞約需3分鐘、1.5分鐘、1分鐘。二者的結(jié)果相符。根據(jù)上述結(jié)果可知，在進(jìn)行HepG2細(xì)胞的消化時(shí)，先用pH7.2的PBS洗滌三遍后，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化0.5分鐘效果比較好。
推薦使用如下方法進(jìn)行消化：效果明顯，對(duì)細(xì)胞的影響小。一般適宜的消化方法是：用1×PBS將細(xì)胞洗滌2次 再加入適量的0.15%胰蛋白酶（含有0.02%EDTA并以7：3的體積比混合）覆蓋細(xì)胞約20秒后吸去胰蛋白酶 （含有0.02%EDTA并以7：3的體積比混合）。
3. 培養(yǎng)基中血清濃度的選擇
由于人肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)緩慢，惡性程度較高，對(duì)于血清的要求比較嚴(yán)格，其培養(yǎng)時(shí)所需要胎牛血清的濃度要比一般的腫瘤細(xì)胞高一些。在含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中HepG2人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)迅速。血清含量為20%時(shí), HepG2細(xì)胞貼壁后增殖速度最快。當(dāng)HepG2細(xì)胞增殖數(shù)代后, 待其狀態(tài)穩(wěn)定時(shí), 可將血清含量逐漸降至10%。
4. 雙抗?jié)舛鹊倪x擇
通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選發(fā)現(xiàn)，雙抗?jié)舛葹?.5%時(shí)傳代效果較好，條件易于控制，且細(xì)胞能順利生長(zhǎng)。
5. 培養(yǎng)基pH條件的選擇
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇細(xì)胞和傳代細(xì)胞在pH6.8-7.4、5% CO₂條件下培養(yǎng)，其貼壁和增值速度無(wú)明顯變化。
而無(wú)CO₂條件下培養(yǎng)時(shí)，復(fù)蘇細(xì)胞在不同pH值條件下均表現(xiàn)為培養(yǎng)液逐漸變堿性，細(xì)胞不能貼壁，且逐漸縮小，退化；傳代細(xì)胞在不同pH值條件下培養(yǎng)，其培養(yǎng)液逐漸變酸性,當(dāng)pH值﹥7.0時(shí)，經(jīng)24h培養(yǎng)后，細(xì)胞基本貼壁，但增值緩慢，經(jīng)48h培養(yǎng)后大部分細(xì)胞已伸出偽足，細(xì)胞數(shù)量明顯增多；當(dāng)pH值﹤7.0時(shí)，細(xì)胞貼壁困難，經(jīng)72h培養(yǎng)后，細(xì)胞縮小、呈退化趨勢(shì)。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選發(fā)現(xiàn)，pH7.2時(shí)傳代效果較好，條件易于控制，且細(xì)胞能順利生長(zhǎng)，與上述結(jié)果相符。6. 細(xì)胞傳代條件的選擇
通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)HepG2細(xì)胞的傳代條件進(jìn)行優(yōu)選，推薦在細(xì)胞匯合度達(dá)95%-100%時(shí)進(jìn)行傳代。
研究結(jié)果表明HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度50%～95%時(shí)是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,死細(xì)胞相對(duì)較少;而當(dāng)匯合度達(dá)到 100%時(shí) ,生長(zhǎng)趨于平臺(tái)期 ,死細(xì)胞數(shù)開(kāi)始增加;特別是匯合度 100%以后再繼續(xù)培養(yǎng),死細(xì)胞數(shù)明顯增加而活細(xì)胞數(shù)減少。據(jù)此可確定 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)最佳的傳代時(shí)期是在匯合度 95%～100%之間。二者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，推薦在匯合度在95%-100%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。
