細胞攻略--SH-SY5Y(人神經(jīng)母細胞瘤細胞)細胞培養(yǎng)教程

 
細胞名稱： SH-SY5Y(人神經(jīng)母細胞瘤細胞)
細胞別稱： SHSY5Y; SHSY-5Y; SH-Sy5y; SK-SH-SY5Y; SY5Y
細胞貨號： SNL-092
生長特性： 貼壁
培養(yǎng)條件： DMEM+10% FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境：空氣，95%；二氧化碳 (CO2)，5%
細胞簡介： SH-SY5Y細胞是SK-N-SH細胞系經(jīng)3次克隆后的亞系(SK-N-SH→SH-SY→SH-SY5→SH-SY5Y)，母株SK-N-SH細胞是1970年來源于4歲女性患者骨瘤轉(zhuǎn)移灶的神經(jīng)母細胞瘤。SH-SY5Y細胞具有中等水平的多巴胺-β-羥基酶活性，細胞生長飽和密度大于1×10^6/cm^2。SH-SY5Y細胞可以用于3D細胞培養(yǎng)、高通量篩選、免疫學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、毒理學(xué)研究，也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。
 
1、細胞貼壁較弱
細胞貼壁比較弱，因此在遇到運輸?shù)蜏丶罢鹗帯⑹覝仂o置太長時間、添加的培養(yǎng)基或其他試劑過冷、密度較高、聚集未吹散、加液吹打到細胞面等情況時會出現(xiàn)明顯的成片脫落現(xiàn)象，此時若脫落現(xiàn)象不嚴(yán)重應(yīng)盡快放回培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，若呈大片脫落的情況時需要收集細胞重新消化吹散并接種；
建議使用經(jīng)過包被或者高貼壁培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細胞，盡量避免接觸低溫或密度過高；
 
2、細胞本身偏嗜酸性，消耗培養(yǎng)基較快
有細胞在略微偏酸性的環(huán)境下生長狀態(tài)會比偏堿性的好，注意培養(yǎng)基pH控制；
細胞密度達到70%以上時，培養(yǎng)基消耗會很快，主意及時觀察并換液；
3、細胞生長到完全匯合時間較長
細胞呈島狀生長，生長是逐漸向外發(fā)射狀增多，最終生長成片，但仍會有較多細胞間間隙；
4、細胞聚團后很難再吹散
細胞傳代過程中一定要注意吹散細胞，接種密度不要過高，否則接種后細胞聚團將很難再吹散，會形成類似神經(jīng)球的聚集體貼壁生長，培養(yǎng)條件合適的情況下細胞會逐漸攤開生長，但若培養(yǎng)條件無法有效促進細胞貼壁，可能會長時間呈球狀增殖；
 
常溫細胞：
❖1.T25瓶收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養(yǎng)箱靜置2-4h；
 
❖2.吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 ml，顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片，觀察細胞密度，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（首次傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 ml繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度80%以上再進行傳代培養(yǎng)；

凍存細胞：
❖1.細胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復(fù)蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰完全揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細胞并聯(lián)系銷售人員解決；
 
❖2.凍存細胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查，以免超出售后期，復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略；
❖3.復(fù)蘇一管細胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進行下一步操作；

Tips：
 
1.細胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完全揮發(fā)等異常情況時，及時拍照聯(lián)系銷售人員；
 
2.該細胞貼壁生長，T25瓶運輸過程中經(jīng)常出現(xiàn)大量細胞脫落并聚團的情況，細胞脫落建議按以下步驟處理：   
收貨發(fā)現(xiàn)細胞脫落聚集，可以將所有細胞收集起來，在50ml離心管內(nèi)離心，上清保存?zhèn)溆茫�再用PBS重懸細胞，盡量吹散后離心棄上清。
沉淀用1ml胰酶重懸，放37度消化2min，先輕輕吹散細胞，再加4ml左右完全培養(yǎng)基終止消化吹散細胞至無肉眼可見團塊，離心棄上清，加第一步保存的培養(yǎng)基重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶。由于貼壁較弱細胞消化時間本身較短，注意必須控制消化時間和吹打力度，避免細胞消化或吹打死亡過多導(dǎo)致無法正常貼壁生長。
由于運輸會脫落的細胞本身貼壁較弱，建議使用高貼附培養(yǎng)瓶或提前包被過的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細胞。
 
3.該尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內(nèi)含對應(yīng)細胞的完全培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續(xù)細胞培養(yǎng)；
   
❖1.先盡量吸干凈T25瓶原培養(yǎng)基，再加3-4ml 常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20s，吸走潤洗的PBS；
 
❖2.T25瓶加1ml左右胰酶，輕輕晃動培養(yǎng)瓶以使胰酶鋪勻瓶底細胞層，將培養(yǎng)瓶放入37度培養(yǎng)箱消化；
 
❖3.消化到細胞間隙變大，但未完全脫落時加2-3ml完全培養(yǎng)基終止胰酶消化；
 
❖4.混勻細胞，900rpm離心3-5min，棄上清；
 
❖5.加新的完全培養(yǎng)基輕輕重懸細胞，均勻分到新的培養(yǎng)瓶里，補足完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；
 
Tips：
 
1.對于消化細胞程度，客戶如果經(jīng)驗不多，無法準(zhǔn)確掌控胰酶作用時間，建議客戶按照下述操作：胰酶首先復(fù)溫到室溫后加入細胞，放入37度培養(yǎng)箱，然后每隔30秒，即吹打下細胞（此時吹打細胞應(yīng)盡量輕柔，不能強行將細胞吹下，否則細胞可能出現(xiàn)機械損傷），如果能夠吹打散細胞，說明細胞消化完成可以終止消化，如果30秒吹打不下，再等30秒重復(fù)操作直至能夠輕柔的吹下細胞；LNCaP clone FGC細胞貼壁較弱，所以消化時間會比常規(guī)貼壁細胞短很多，注意控制消化時間；
 
2.T25瓶加10-12ml完全培養(yǎng)基，10cm皿加12-15ml，2-3天換液一次。
 
3.細胞收貨后首次傳代建議按1：2傳代，后續(xù)培養(yǎng)可以視具體細胞生長狀態(tài)和密度情況決定傳代比例；
 
4.傳代后24h建議觀察細胞并換液一次去除死亡細胞；
  凍存步驟：
❖1.先將細胞按傳代步驟消化、離心，至傳代步驟4，棄細胞上清，獲得細胞沉淀；
 
❖2.加入適量預(yù)先配好的程序性凍存液輕輕重懸細胞，并將細胞懸液轉(zhuǎn)移至做好標(biāo)記的凍存管中；
 
❖3.將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；
 
❖4.轉(zhuǎn)移細胞至液氮保存并登記細胞保存位置，液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長期保存，若低于80%建議重新凍存；

Tips：
 
1.檢測凍存細胞活性結(jié)果未合格前，培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞建議繼續(xù)培養(yǎng)直至確認(rèn)凍存合格方可視需要丟棄；
2.程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液可以按產(chǎn)品說明書處理降溫過程； 
3.T25培養(yǎng)瓶長滿通�？梢詢龃�2-3管，10cm皿長滿可以凍存3-4管；
  復(fù)蘇步驟：
 
❖1. 將所需的完全培養(yǎng)基放在培養(yǎng)箱預(yù)熱30min后開始復(fù)蘇；
❖2. 準(zhǔn)備37度溫水，將細胞從液氮罐取中出，觀察管內(nèi)無液氮的情況下，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入溫水輕輕搖晃，融化至米粒大小冰塊，終止水浴；
❖3. 將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心1-2min，不同離心機具體轉(zhuǎn)速會有差異；
❖4. 離心完成后棄凍存液，用剛才預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，并輕柔重懸細胞后接種至T25或者10cm皿中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱；
❖5. 24h后觀察細胞并換液一次，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；
 
Tips:
 
1.凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細胞時震動不要過大，水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮建議靜置一會待液氮完全蒸發(fā)后再水浴；
 
2.水浴時可以使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，可以降低管蓋縫隙滲入水導(dǎo)致污染的概率；
 
3.水浴至剩米粒大小時及時終止水浴，避免過度水浴或水浴時間不足；
 
4.建議水浴完成后直接在離心管內(nèi)離心細胞，避免再次轉(zhuǎn)移細胞；
 
5.復(fù)蘇后的細胞比較脆弱，吹打和轉(zhuǎn)移細胞時盡量輕柔，復(fù)蘇24h后換液去除死亡細胞；
 
1、細胞密度怎么計算的？
嚴(yán)格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數(shù)細胞數(shù)量，但在實際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細胞數(shù)量而消化細胞計數(shù)。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當(dāng)然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn)，但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細胞狀態(tài)的一種方式；

2、培養(yǎng)過程中細胞碎片較多怎么處理？
01.細胞內(nèi)的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現(xiàn)象，只是不同細胞顆粒多少有區(qū)別，細胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。
 
02.細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞，消化完成后加完全培養(yǎng)基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細胞，再離心后，用完全培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

3、細胞具體消化時間是多久？
每個客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能完全規(guī)定消化時間，以實際消化效果和客戶經(jīng)驗為準(zhǔn)。 

4、細胞培養(yǎng)瓶是怎么包被的？
細胞培養(yǎng)瓶包被方法有很多，例如多聚賴氨酸、明膠、鼠尾膠原等，不同的包被原理和效果都不太一樣，具體可以根據(jù)實際實驗室條件選擇合適的包被材料。注意包被后應(yīng)及時使用，包被后放的時間越長效果越來越差的。
市面上也有特殊處理的培養(yǎng)瓶可以選擇，常規(guī)TC處理或者corning的cellbind型號培養(yǎng)瓶都是不錯的選擇。

5、細胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)聚團現(xiàn)象怎么處理？
細胞傳代過程中建議盡可能吹散細胞，并在顯微鏡下確認(rèn)細胞基本分散后再接種細胞；
細胞培養(yǎng)建議使用優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)體系并保證溫度、濕度、二氧化碳濃度適宜，能有效避免細胞吹散后在貼壁時再聚團的現(xiàn)象， 也可以減輕細胞聚團后無法重新攤開生長的癥狀；
培養(yǎng)過程中輕微聚團可以稍微延長消化時間并在消化終止后將細胞懸液靜置1-2min，讓大團細胞下沉后盡量吸取上層的分散細胞傳代，聚團過于嚴(yán)重的建議重新培養(yǎng)或者更換培養(yǎng)體系；
 
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