滸苔多糖干預(yù)可通過調(diào)節(jié)腸道微生物群和膽汁酸代謝緩解高膽固醇血癥

文章標(biāo)題：Polysaccharides from Enteromorpha prolifera alleviate hypercholesterolemia via modulating the gut microbiota and bile acid metabolism
發(fā)表期刊：Food & Function
影響因子：6.317
作者單位：福建醫(yī)科大學(xué)
百趣提供服務(wù)：16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序，膽汁酸檢測(cè)

研究背景
高膽固醇血癥，定義為過高的血清總膽固醇(total Cholesterol, TC)或低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)，是心血管疾病和阿爾茨海默病的重要危險(xiǎn)因素。膽固醇穩(wěn)態(tài)需要各組織和器官的合作，尤其是腸-肝軸。大量研究表明，膽汁酸(bile acids, BAs)、膽汁酸激活受體以及膽汁酸代謝細(xì)菌等在調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮基本功能。膽汁酸的生物合成是膽固醇的主要分解途徑，約40%的膽固醇可在肝臟中分解為膽汁酸。

膽汁酸在腸內(nèi)分泌后，通過腸道菌群進(jìn)行解離和修飾，形成多種次級(jí)膽汁酸。已有研究闡明，腸道微生物除了調(diào)節(jié)膽汁酸的合成和代謝，也參與高膽固醇血癥的促進(jìn)和發(fā)展。因此，膽汁酸穩(wěn)態(tài)可能是高膽固醇血癥進(jìn)展中腸道微生物群改變與肝細(xì)胞膽固醇代謝之間的聯(lián)系之一。滸苔多糖(Enteromorpha prolifera, EP)具有多種生物學(xué)活性，但其在高膽固醇血癥中的作用及其與腸道菌群的關(guān)系尚不清楚。

本研究選取50只C57BL/6J雄性小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)、高脂高膽固醇飲食組(HFHC)、低劑量EP高脂高膽固醇飲食組(HFHC+LEP)、中劑量EP高脂高膽固醇飲食組(HFHC+MEP)和高劑量EP高脂高膽固醇飲食組(HFHC+HEP)，持續(xù)喂食12周后收集血清、肝臟和糞便樣本，經(jīng)過血清指標(biāo)篩選最終選取對(duì)照組、HFHC和HFHC+HEP樣本進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序和膽汁酸檢測(cè)，驗(yàn)證EP可通過腸道微生物-膽汁酸代謝軸改善高膽固醇血癥小鼠代謝功能障礙的假設(shè)。

研究結(jié)果
1.EP可減輕高膽固醇血癥和肝臟膽固醇沉積
12周喂食處理后，五組小鼠體重沒有差異（圖1A）。與對(duì)照組相比，HFHC組血清TC和LDL-C增加，高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)降低，表明HFHC組成功誘導(dǎo)了小鼠的高膽固醇血癥。與HFHC組相比，EP干預(yù)顯著降低血清TC水平（圖1B）。此外，與HFHC組相比，只有高劑量EP干預(yù)顯著降低了血清LDL-C濃度和肝臟指數(shù)，升高HDL-C水平（圖1D-1F）。結(jié)果顯示，EP干預(yù)可劑量依賴性地降低血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)水平（圖1H），恢復(fù)肝功能。研究結(jié)果表明，高劑量（300mg/kgBW）EP對(duì)小鼠可顯著緩解高膽固醇血癥，并將高劑量EP干預(yù)用于后續(xù)研究。
 

圖1. EP減輕HFHC小鼠高膽固醇血癥

肝臟切片的組織病理學(xué)調(diào)查顯示，HFHC組肝臟存在炎癥病變，EP干預(yù)后炎癥病變明顯減輕（圖2A）。此外，肝臟TC含量顯示EP干預(yù)顯著降低了肝臟膽固醇沉積（圖2B），三組肝臟甘油三酯(triglycerides, TG)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2C）。這些結(jié)果也表明，高劑量EP干預(yù)可顯著緩解高膽固醇血癥肝臟膽固醇沉積。
 

圖2. EP可降低HFHC小鼠肝臟膽固醇沉積并恢復(fù)肝功能

2.EP促使與膽固醇吸收和消除相關(guān)的mRNA和蛋白質(zhì)上調(diào)
為了探索EP降低肝臟膽固醇沉積的分子機(jī)制，本研究檢測(cè)了膽固醇調(diào)節(jié)基因LDLR、SREBP2、HMGCR，以及膽汁酸合成相關(guān)基因CYP7A1、CYP27A在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況。與HFHC組相比，EP干預(yù)使LDLR的mRNA水平和蛋白水平（圖3A和3E）顯著上調(diào)。此外，與HFHC組相比，HFHC+HEP組中膽固醇合成的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SREBP2的mRNA和蛋白質(zhì)豐度略有增強(qiáng)（圖3B和3E）。與HFHC組相比，EP干預(yù)顯著上調(diào)了肝臟中HMGCR的mRNA水平和蛋白豐度（圖3B和3E）。

膽汁酸合成是膽固醇分解代謝和消除的重要途徑。EP干預(yù)顯著提高了調(diào)節(jié)膽汁酸合成的兩種關(guān)鍵酶CYP7A1和CYP27A1的mRNA和蛋白水平（圖3C和3E）。與喂食HFHC組相比，HFHC+HEP組中介導(dǎo)膽汁酸代謝的法尼類X受體(farnesoid X receptor, FXR)的基因表達(dá)上調(diào)（圖3D）�？傊�，這些結(jié)果表明，膳食EP干預(yù)可以通過促進(jìn)肝臟中膽汁酸的產(chǎn)生來緩解肝臟膽固醇沉積。
 

圖3. 膽固醇調(diào)節(jié)基因的mRNA和蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平

3.EP干預(yù)重塑糞便微生物群落
為了加深腸道微生物因子與肝臟膽固醇代謝的潛在相關(guān)性，通過16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序研究糞便微生物群落的組成。如圖所示，三組間微生物Chao1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)(Shannon-Wiener index, Shanon)無顯著差異（圖4A和4B）。通過Unifrac基于距離的主坐標(biāo)分析(Principal Coordinates Analysis, PCoA)，發(fā)現(xiàn)HFHC組和對(duì)照組明顯分離，HFHC組和HFHC+HEP組之間的樣品也顯著差異（圖4C）。非度量多維標(biāo)度(Non-metric multidimensional scaling, NMDS)分析顯示HFHC+HEP組和HFHC組明顯分離（圖4D），表明EP干預(yù)誘導(dǎo)了腸道菌群組成的重塑。
 

​圖4. 不同飲食小鼠腸道菌群的α和β多樣性分析

物種豐度分析結(jié)果表明，EP干預(yù)能顯著提高門水平上擬桿菌門(Bacteriodetes)相對(duì)豐度，降低變形菌門(Proteobacteria)的相對(duì)豐度（圖5A、5B）。HFHC處理組擬桿菌門(Bacteriodetes)與變形菌門(Proteobacteria)比值降低，EP處理后顯著升高（圖5C），在屬水平上也觀察到類似的菌群變化（圖5D）。所有樣本屬水平物種豐度統(tǒng)計(jì)顯示，與對(duì)照組相比，HFHC組小鼠Escherichia_shigella、Parasutterella和Allobaculum屬相對(duì)豐度增加，norank_f_Muribaculaceae和Ileibacterium的相對(duì)豐度降低（圖5E）。
 

圖5. EP可調(diào)節(jié)HFHC小鼠腸道微生物組成

采用線性判別分析(Linear discriminant analysis Effect Size, LEfSe)找到不同比較組間在豐度上有顯著性差異的物種。HFHC+HEP組與HFHC+HEP組LEfSe分析結(jié)果顯示，HFHC+HEP組Clstridium_sensu_stricto_13和Clostridiaceae_1顯著富集，表明EP處理增強(qiáng)了腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)，重塑了糞便微生物群落。
 

圖6. LEfSe分析結(jié)果

4.EP干預(yù)改變了糞便膽汁酸代謝模式
UHPLC-MS/MS靶向檢測(cè)共鑒定出34種膽汁酸，其中有24種游離型膽汁酸和10種結(jié)合型膽汁酸。與對(duì)照組相比，HFHC組有10種結(jié)合型膽汁酸上調(diào)，7種游離型膽汁酸下調(diào)。與HFHC組相比，HFHC+HEP組結(jié)合型膽汁酸的比例明顯降低，而游離型膽汁酸在三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖7A和7B）�？偰懼�酸分析顯示，與HFHC組相比，EP顯著降低了糞便中牛磺酸結(jié)合型膽汁酸和甘氨酸結(jié)合型膽汁酸的含量（圖7C和7D）。HFHC組小鼠膽汁酸的總水平也顯著提高，約為對(duì)照組小鼠的10倍（圖7E）。然而，EP治療未引起總膽汁酸、初級(jí)膽汁酸和次級(jí)膽汁酸的顯著變化（圖7F和7G）。
 

圖7. EP降低糞便中結(jié)合型膽汁酸含量

5.腸道菌群、糞便膽汁酸與血脂的相關(guān)性分析
為了探討EP對(duì)腸道菌群-腸道-肝臟軸的潛在影響，作者采用Spearman相關(guān)分析檢驗(yàn)血清TC、LDL-C和HDL-C與腸道菌群的關(guān)系。在門水平上，放線菌門(Actinobacteria)、髕骨細(xì)菌門(Patescibacteria)和擬桿菌門(Bacteriodetes)的相對(duì)豐度與肝臟指數(shù)、血清TC和LDL-C呈較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，而變形菌門(Proteobacteria)的相對(duì)豐度與肝臟指數(shù)、血清TC和LDL-C呈正相關(guān)（圖8A）。屬水平上分析證實(shí)，主要的降膽固醇菌屬有norank_f_Muribaculaceae、Ileibacterium、Candidatus_Saccharimonas、和Lachnospiraceae_NK4A136_group （圖8B），它們與TC和LDL-C呈負(fù)相關(guān)。

通過Spearman相關(guān)分析，探討了微生物與膽汁酸的相關(guān)性（圖8C和圖8D）。結(jié)果顯示，變形菌門(Proteobacteria)相對(duì)豐度與總的結(jié)合型膽汁酸呈顯著正相關(guān)(r=0.33，P=0.10)。相比之下，擬桿菌門(Bacteriodetes)門相對(duì)豐度與總結(jié)合型膽汁酸呈負(fù)相關(guān)(r=-0.40，P=0.03)。在屬水平上，norank_f_Muribaculaceae與結(jié)合型膽汁酸呈負(fù)相關(guān)(r=−0.46，P=0.01)。
 

圖8. 腸道菌群、膽汁酸和膽固醇相關(guān)指標(biāo)的Spearman相關(guān)性分析

結(jié)論
本研究首次報(bào)道了EP干預(yù)可以通過調(diào)節(jié)腸道微生物群和膽汁酸代謝來緩解高膽固醇血癥和肝臟膽固醇沉積。該結(jié)果加深了膳食益生元對(duì)全身膽固醇代謝影響的認(rèn)識(shí)，激發(fā)了通過微生物-腸道-肝臟代謝途徑治療高脂血癥的替代策略的發(fā)展。