空間轉(zhuǎn)錄組報(bào)道植物維管組織結(jié)構(gòu)與發(fā)育研究領(lǐng)域新進(jìn)展中的應(yīng)用

自空間轉(zhuǎn)錄組被評為2020年nature methods年度技術(shù)后，不同的空間組學(xué)平臺如雨后春筍般展現(xiàn)在了大眾的視野內(nèi)，其中，10x Genomcs的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)走在了科研的前列，10x Genomcs Visium基于poly(dT)的無偏差RNA捕獲方式給了空間轉(zhuǎn)錄組更廣泛的應(yīng)用空間和物種適應(yīng)性。

10X Genomcs Visium從技術(shù)建立至今的四年中，絕大多數(shù)的樣本是以人或小鼠等動物為主。但植物相關(guān)的空間轉(zhuǎn)錄組文章所見甚少，那么植物和動物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和成分差異亦或是在前期植物冰凍切片時(shí)的難度可能是阻礙植物使用空間轉(zhuǎn)錄組的難點(diǎn)。

上海伯豪生物的實(shí)驗(yàn)研發(fā)團(tuán)隊(duì)通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化摸索，最終在植物樣本的冰凍包埋，切片，樣本透化過程建立了一套伯豪自己的解決方案。并成功在擬南芥、楊樹、 槐樹等多種植物類型中進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，積累了豐富的植物空轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。其中，楊樹是最具代表性的案例。該研究成果由浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院杜娟課題組發(fā)表在Molecular Plant上，回答了植物學(xué)領(lǐng)域爭論了120年的科學(xué)問題：即植物的次生維管組織發(fā)育過程中，韌皮部細(xì)胞和木質(zhì)部細(xì)胞是來源于一個(gè)共同的干細(xì)胞中心，還是分別來源于兩個(gè)干細(xì)胞中心？
 

圖1 楊樹莖次生維管組織中存在兩類干細(xì)胞群
分別位于韌皮部與形成層組織
（Pf，韌皮纖維；Ph,韌皮部；CZ,形成層; DX,木質(zhì)部；Pa，薄壁細(xì)胞；Ve，導(dǎo)管分子；F，形成層區(qū)紡錘形原始干細(xì)胞；R， 形成層區(qū)射線原始細(xì)胞；PCL，韌皮部類似干細(xì)胞群）

后續(xù)作者運(yùn)用10x Genomcs Visium空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，分析了楊樹莖從初生生長到次生生長連續(xù)發(fā)育過程中，原形成層干細(xì)胞衍生的子細(xì)胞分別分化形成韌皮部干細(xì)胞，以及維管形成層干細(xì)胞的特征表達(dá)的基因（圖2）。
 

圖2 空間轉(zhuǎn)錄組分析與原位雜交驗(yàn)證次生維管組織中
存在兩個(gè)干細(xì)胞中心
（PCL，韌皮部干細(xì)胞；CZ,形成層干細(xì)胞；R， 射線原始細(xì)胞）

基于以上三方面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，作者進(jìn)而提出了關(guān)于木本植物次生維管系統(tǒng)發(fā)育的一個(gè)新的理論模型 （圖3）。
 

圖3 楊樹莖初生維管組織與次生維管組織發(fā)育模式圖

最后作者運(yùn)用擬時(shí)序分析方法，分析了從初生分生組織干細(xì)胞到次生分生組織干細(xì)胞分化過程中的基因表達(dá)規(guī)律（圖4A）；以及兩類次生維管組織干細(xì)胞分別分化形成韌皮部細(xì)胞與木質(zhì)部細(xì)胞過程中的基因表達(dá)規(guī)律（圖4B）。
 

圖4 從初生到次生分生組織（A），
及次生分生組織分化過程的基因表達(dá)趨勢規(guī)律（B）

本研究首次系統(tǒng)解析了植物次生維管組織干細(xì)胞的起源發(fā)生與發(fā)育過程，提供了維管組織干細(xì)胞及其衍生細(xì)胞在各個(gè)分化階段的形態(tài)結(jié)構(gòu)與特征表達(dá)基因圖譜，為進(jìn)一步研究陸生植物維管組織系統(tǒng)演化提供了非常重要的資源。同時(shí)也為篩選維管組織發(fā)育與木材形成的關(guān)鍵調(diào)控因子進(jìn)行分子育種，改良植物株型，調(diào)控植物生長發(fā)育與抗逆提供新的研究視角。  

伯豪生物經(jīng)驗(yàn)
由于植物樣本的特殊性，在前期樣本準(zhǔn)備過程中，遇到了比較多的困難，如植物樣本如何進(jìn)行冰凍包埋，以及植物樣本切片易碎裂的問題，在經(jīng)過了較多次的嘗試與分析后，確定了比較好的樣本收集及切片方法。

同時(shí)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中，由于植物樣本和動物樣本的差異性，在實(shí)驗(yàn)試劑上也較常規(guī)試劑盒做了更改，例如在樣本透化過程中，由于植物樣本具有細(xì)胞壁，很難將mRNA透化出來，所以我們根據(jù)楊樹細(xì)胞壁的成分，添加了不同的蛋白酶，去進(jìn)行預(yù)透化。并且，在實(shí)驗(yàn)前期我們也與空轉(zhuǎn)發(fā)明人瑞典科學(xué)家Joakim Lundeberg進(jìn)行了溝通交流，最終確定下適合植物樣本的試劑方案。后續(xù)在數(shù)據(jù)分析過程中，我們也和杜老師多次溝通，摸索出了一套植物空轉(zhuǎn)特有的分析方案。

目前上海伯豪生物在植物空轉(zhuǎn)樣本類型上已經(jīng)有較多的嘗試，如擬南芥、楊樹、 槐樹等植物類型我們都進(jìn)行過包埋和切片實(shí)驗(yàn)，也都有較豐富的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。