利用非靶向和靶向代謝組學(xué)鑒定雞肉中腸炎沙門氏菌的代謝標(biāo)志物

文章標(biāo)題：Untargeted and targeted metabolomics identify metabolite biomarkers for Salmonella enteritidis in chicken meat

發(fā)表期刊：Food Chemistry

影響因子：9.23

作者單位：揚(yáng)州大學(xué)

百趣提供服務(wù)：發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)Classic-親水版、600MRM

百趣代謝組學(xué)—研究背景

近年來，食品安全問題一直是世界各國廣泛關(guān)注的問題。雞肉由于其高蛋白、低脂肪、低熱量和低膽固醇的特性，已成為全世界消費者接受的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源。腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)是一種常見的食源性細(xì)菌。

百趣代謝組學(xué)分享，據(jù)統(tǒng)計，世界上每年感染沙門氏菌的人數(shù)達(dá)到8000萬至9400萬，其中5.9萬至15.5萬人死亡。因此，監(jiān)測和控制雞肉中的沙門氏菌污染對于保障消費者的健康和生命安全至關(guān)重要。

而傳統(tǒng)的微生物檢測法、免疫學(xué)法以及PCR檢測技術(shù)已不能滿足快速高效檢測現(xiàn)代食源性病原體的要求，本研究結(jié)合非靶向和靶向代謝組學(xué)旨在發(fā)現(xiàn)雞肉中腸炎沙門氏菌污染的代謝生物標(biāo)志物。

百趣代謝組學(xué)—實驗設(shè)計

（1）樣本類型：雞肉組織

（2）發(fā)現(xiàn)集（非靶向檢測）

分組：0h（對照組，接種沙門氏菌培養(yǎng)0小時，n=10）；6h（接種沙門氏菌培養(yǎng)6小時，n=10）；12h（接種沙門氏菌培養(yǎng)12小時，n=10）；18h（接種沙門氏菌培養(yǎng)18小時，n=10）。

（3）驗證集（靶向檢測）

污染組（接種沙門氏菌培養(yǎng)18小時，n=10）和對照組（新鮮雞肉樣品，n=10）（圖1）。
 

百趣代謝組學(xué)—研究結(jié)果
1.雞肉中腸炎沙門氏菌的非靶代謝譜及差異物篩選
通過非靶向檢測，正離子模式(POS)和負(fù)離子模式(NEG)分別檢測出441和240種代謝產(chǎn)物。并使用多元統(tǒng)計分析對腸炎沙門氏菌污染不同時期的代謝物進(jìn)行主成分分析(PCA)，結(jié)果表明，四組在第一個主成分存在顯著分離，且同組實驗樣本及QC樣本聚集性較好，表明系統(tǒng)的穩(wěn)定性和采集數(shù)據(jù)的可靠性（如圖2E-F）。百趣代謝組學(xué)分享，接下來作者對檢測的代謝物進(jìn)一步進(jìn)行了差異物質(zhì)篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05和FC>1.5。結(jié)果表明，在正離子模式下篩選了238種差異代謝物，其中157種上調(diào)，81種下調(diào)。百趣代謝組學(xué)分享，在負(fù)離子模式下，篩選了174種差異代謝物，其中57種表達(dá)上調(diào)，117種表達(dá)下調(diào)。并通過火山圖展示了不同比較組的差異代謝物（圖3）。

圖2. 主成分分析（E，正離子模式；F，負(fù)離子模式）

圖3. 火山圖分析（A，正離子模式；B，負(fù)離子模式）

2.潛在代謝產(chǎn)物生物標(biāo)志物的鑒定

接下來作者對以上差異物質(zhì)進(jìn)行了OPLS回歸分析，獲得了穩(wěn)健且具有良好預(yù)測效果的模型（圖4）。并通過OPLS回歸分析得到的PreVIP值（PreVIP>1.5）進(jìn)一步篩選出30種代謝產(chǎn)物為腸炎沙門氏菌感染的潛在生化標(biāo)志物（圖5AB）。百趣代謝組學(xué)分享，根據(jù)HMDB數(shù)據(jù)庫中的二級分類將30種代謝產(chǎn)物分為6類，即有機(jī)酸及其衍生物（34.375%）、有機(jī)雜環(huán)化合物（25%）、脂類和類脂分子（21.875%）、無機(jī)氮化合物（12.5%）、核苷，核苷酸及其類似物（3.125%）和有機(jī)化合物（3.125%）（圖5C）。

圖4. OPLS回歸模型分析（ACE，正離子模式；BDF，負(fù)離子模式）

圖5. 雞肉腸炎沙門氏菌潛在代謝生物標(biāo)志物的鑒定

3. 潛在代謝產(chǎn)物生物標(biāo)志物的代謝途徑分析

作者使用Metalanalyst5.0對30種潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行了通路富集分析（圖6）。結(jié)果表明，30個潛在的生物標(biāo)志物共富集到21個代謝通路途徑，其中6個通路富集顯著（P<0.05），包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成途徑、脂代謝途徑、組氨酸、泛酸鹽和CoA生物合成途徑、檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）和tRNA生物合成途徑。百趣代謝組學(xué)分享，有研究表明，在肉類中，碳水化合物和某些氨基酸是腐敗相關(guān)代謝產(chǎn)物的前體，另外游離氨基酸可能是細(xì)菌的生長促進(jìn)劑。因此，富集的代謝途徑對雞肉腸炎沙門氏菌污染和惡化至關(guān)重要。

圖6. 生物標(biāo)志物的代謝途徑富集分析

4.靶向代謝組學(xué)分析（驗證集）

為了準(zhǔn)確識別受腸炎沙門氏菌污染的雞肉和新鮮雞肉之間的代謝生物標(biāo)志物，作者基于非靶向代謝組學(xué)篩選出的候選生物標(biāo)志物，進(jìn)一步對腸炎沙門氏菌污染的雞肉和新鮮雞肉進(jìn)行了UHPLC-QQQ-MS靶向定量分析。為了反映腸炎沙門氏菌污染的雞肉和新鮮雞肉之間的差異，進(jìn)行了OPLS-DA建模分析，并使用7倍交叉驗證驗證了模型質(zhì)量。結(jié)果表明腸炎沙門氏菌污染的雞肉和新鮮雞肉間存在較大代謝差異，且OPLS-DA模型是穩(wěn)健的，沒有過度擬合（圖7）。

另外通過P＜0.05和VIP＞1篩選出其中5種代謝物作為雞肉中腸炎沙門氏菌污染的生物標(biāo)志物，包括乙酰膽堿、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-纈氨酸和L-正亮氨酸，且這5種代謝物在非靶代謝譜結(jié)果中也是潛在差異物。接著對這5種代謝物進(jìn)行歐氏距離矩陣分析法對差異代謝物進(jìn)行聚類，結(jié)果如圖所示，5種代謝物在不同組間聚集明顯（圖7A）。百趣代謝組學(xué)分享，同時，箱型圖結(jié)果表明，5種代謝物組間顯著差異，且在污染組都呈現(xiàn)顯著的上調(diào)趨勢（圖8B），作者推測這5種代謝物可能是檢測雞肉中腸炎沙門氏菌污染的潛在生物標(biāo)志物。
 

圖7. 靶標(biāo)代謝組學(xué)OPLS-DA分析

圖8. 5種生物標(biāo)志物的層次聚類和箱型圖分析

5.代謝產(chǎn)物生物標(biāo)志物的ROC分析

ROC曲線用于評估5種代謝產(chǎn)物生物標(biāo)志物的辨別能力。當(dāng)AUC值在0.5-0.7時，AUC具有較低的準(zhǔn)確性；AUC值在0.7-0.9，AUC具有良好的準(zhǔn)確性；如果AUC值高于0.9，則AUC具有較高的準(zhǔn)確性。百趣代謝組學(xué)分享，結(jié)果如圖所示，5種代謝物單獨及聯(lián)合的AUC值均高于0.9（圖9），表明這5種生物標(biāo)志物在預(yù)測雞肉中腸炎沙門氏菌污染方面具有很高的準(zhǔn)確性。
 

圖9. 5種生物標(biāo)志物的ROC曲線分析

百趣代謝組學(xué)—研究結(jié)論

本研究通過整合非靶向和靶向的代謝組學(xué)分析來鑒定雞肉中腸炎沙門氏菌污染的代謝生物標(biāo)志物。百趣代謝組學(xué)分享，30種不同的代謝物被鑒定為候選代謝生物標(biāo)志物。通過基于UHPLC-QQQ-MS的靶標(biāo)代謝組學(xué)，乙酰膽堿、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-纈氨酸和L-正亮氨酸被確認(rèn)為雞肉中腸炎沙門氏菌的代謝生物標(biāo)志物。

在腸炎沙門氏菌污染的雞肉中，5種代謝生物標(biāo)志物的豐度均顯著上調(diào)。總之，本研究的發(fā)現(xiàn)將促進(jìn)快速準(zhǔn)確地檢測雞肉中腸炎沙門氏菌新方法的發(fā)展。