m5C甲基化研究揭示mRNA m5C對維持果蠅生殖干細胞發(fā)育的分子機制
2020年02月18日，Stower研究所解亭教授團隊與南方科技大學李思思團隊合作研究發(fā)現(xiàn)果蠅的YPS蛋白通過優(yōu)先結(jié)合帶有m5C修飾的RNA，從而促進果蠅卵巢生殖干細胞的發(fā)育。該成果以“Drosophila YBX1 homolog YPS promotes ovarian germ line stem cell development by preferentially recognizing 5-methylcytosine RNAs”為題在線發(fā)表在《美國國家科學院院刊》（PNAS）（IF 11.205）期刊上。
摘要：
m5C是一種存在于tRNA和rRNA中的RNA修飾，最近在mRNA中發(fā)現(xiàn)。雖然有人提出m5C RNA修飾可以調(diào)節(jié)多種生物學功能，但m5C RNA修飾是否會影響成體干細胞發(fā)育尚不清楚。在本研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)YPS蛋白（Ypsilon schachtel）是人Y-框結(jié)合蛋白1(Y box binding protein 1 ,YBX1)的人源同類蛋白，可以通過優(yōu)先結(jié)合帶有m5C修飾的RNA，從而促進果蠅卵巢生殖干細胞（GSC）的維持、增殖和分化。遺傳學證明YPS在果蠅卵巢中具有GSC維持、增殖和分化功能，人YBX1可以在功能上替代YPS支持GSC正常發(fā)育。YPS和YBX1的保守冷休克結(jié)構(gòu)域（cold-shock domains,CSD）在體外優(yōu)先與m5C RNA結(jié)合。此外，YPS還優(yōu)先與生殖細胞中帶有m5C修飾的RNA（包括mRNAs）結(jié)合。YBX1 CSD-RNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)表明，疏水相互作用和氫鍵對m5C結(jié)合至關(guān)重要。RNA結(jié)合缺失突變YPS和YBX1蛋白表達會阻礙GSC發(fā)育。綜上所述，研究結(jié)果表明m5C RNA修飾在成人干細胞發(fā)育中起著重要作用。
背景：
近幾年，由于表觀轉(zhuǎn)錄組學的興起，m5C作為mRNA中除 m6A之外另一種廣泛存在的修飾，引起了研究人員們的關(guān)注。然而，其調(diào)控細胞發(fā)育和分化機制的機理目前尚不清楚。
研究材料：
室溫條件下，在標準玉米粉/糖蜜/瓊脂培養(yǎng)基上飼養(yǎng)和雜交果蠅。為最大限度提高shRNA和轉(zhuǎn)基因的表達水平，在分析卵巢表型之前，將新羽化的果蠅在29°C條件下培養(yǎng)2周。取卵巢組織分離RNA用于研究。
結(jié)果：
（1）YPS促進果蠅卵巢的GSC維持，增殖和分化
研究人員們首先發(fā)現(xiàn)YPS蛋白缺失的2周齡果蠅卵巢干細胞顯現(xiàn)出發(fā)育延遲，增值變慢的現(xiàn)象，提示該蛋白對于果蠅生殖干細胞的維持，增殖以及分化具有重要作用。由于YPS的人源同類蛋白YBX1與mRNA m5C甲基化酶NSUN2共定位于外泌體中，且YPS本身含有能夠結(jié)合核酸的保守的cold-shock結(jié)構(gòu)域，研究團隊推測YPS可能通過結(jié)合含有甲基化的mRNA來行使功能。
（2）人YBX1可以在功能上取代YPS，促進果蠅卵巢GSC發(fā)育
為了驗證推測，研究團隊首先在YPS缺失的果蠅生殖干細胞中回補表達人源的同類蛋白YBX1，發(fā)現(xiàn)YBX1可以替代YPS促進果蠅生殖干細胞正常發(fā)育，證明兩個同源蛋白在功能上具有保守性。同時通過Flag-pulldown，免疫共沉淀以及高通量測序的方法發(fā)現(xiàn)YPS確實能在體內(nèi)結(jié)合更多含有m5C修飾的mRNA。
圖2：YPS優(yōu)先與生殖細胞中帶有m5C修飾的RNA結(jié)合
（3）YBX1-CSD主要通過疏水相互作用對帶有m5C修飾的RNA優(yōu)先結(jié)合
研究人員利用ITC以及蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析等技術(shù)，對比YBX1蛋白結(jié)合甲基化修飾的RNA以及非甲基化修飾的RNA的高分辨率復(fù)合物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在YPS和YBX1中高度保守的4個氨基酸（Trp65、Phe74、Phe85、His87）對于識別和結(jié)合甲基化修飾的RNA至關(guān)重要。其中，RNA甲基化增強了RNA與蛋白之間的疏水相互作用，確保YPS和YBX1在體內(nèi)與甲基化的RNA具有更高親和力。
（4）RNA結(jié)合缺失突變YBX1和YPS蛋白表達嚴重打亂GSC發(fā)育
功能實驗證明，當將這些關(guān)鍵位點進行缺失突變之后，YBX1無法與RNA結(jié)合。不能結(jié)合RNA的YPS突變體W65A，F(xiàn)74A以及F85A表現(xiàn)為顯性失活，會打亂果蠅生殖干細胞的發(fā)育。結(jié)果表明，YBX1和YPS中的Trp65，Phe74和Phe85對其體內(nèi)功能至關(guān)重要。
易基因小結(jié)：
本研究結(jié)果表明，YPS通過優(yōu)先識別帶有m5C修飾的RNA來調(diào)節(jié)翻譯、剪接和穩(wěn)定性，從而促進果蠅卵巢中GSC的發(fā)育，揭示了其作為mRNA m5C的結(jié)合蛋白來影響生殖干細胞發(fā)育的分子機制。同時，由于YPS/YBX家族蛋白功能從果蠅到人類都是保守的，研究驗證了人源YBX1蛋白可以替代果蠅YPS蛋白在果蠅卵巢干細胞中的作用，暗示其可能在人類干細胞中具有類似作用，果蠅卵巢或許可以分析人YBX家族蛋白和m5C修飾在生殖細胞發(fā)育中的功能，為未來的人類干細胞治療提出了可能的研究方向。
此前，易基因?qū)Π唏R魚m5C修飾在生理和病理進程中的重要調(diào)控作用、單堿基分辨率下分析人類膀胱尿路上皮癌(UCB)樣本中mRNA的m5C修飾、m5C修飾在哺乳動物mRNA出核和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用、重亞硫酸鹽處理結(jié)合高通量NGS策略，單堿基分辨率檢測人細胞(h)m5C修飾分布等m5C研究成果進行了解讀：m5C RNA甲基化測序技術(shù)---從mRNA到全轉(zhuǎn)錄組（mRNA+lncRNA+tRNA）m5C單堿基分辨檢測，期待更多m5C甲基化修飾功能調(diào)控研究成果。
關(guān)于m5C甲基化測序
易基因提供適用于不同科研需求的m5C甲基化測序技術(shù)：
技術(shù)優(yōu)勢：
研究方向：
參考文獻：
摘要：
m5C是一種存在于tRNA和rRNA中的RNA修飾，最近在mRNA中發(fā)現(xiàn)。雖然有人提出m5C RNA修飾可以調(diào)節(jié)多種生物學功能，但m5C RNA修飾是否會影響成體干細胞發(fā)育尚不清楚。在本研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)YPS蛋白（Ypsilon schachtel）是人Y-框結(jié)合蛋白1(Y box binding protein 1 ,YBX1)的人源同類蛋白，可以通過優(yōu)先結(jié)合帶有m5C修飾的RNA，從而促進果蠅卵巢生殖干細胞（GSC）的維持、增殖和分化。遺傳學證明YPS在果蠅卵巢中具有GSC維持、增殖和分化功能，人YBX1可以在功能上替代YPS支持GSC正常發(fā)育。YPS和YBX1的保守冷休克結(jié)構(gòu)域（cold-shock domains,CSD）在體外優(yōu)先與m5C RNA結(jié)合。此外，YPS還優(yōu)先與生殖細胞中帶有m5C修飾的RNA（包括mRNAs）結(jié)合。YBX1 CSD-RNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)表明，疏水相互作用和氫鍵對m5C結(jié)合至關(guān)重要。RNA結(jié)合缺失突變YPS和YBX1蛋白表達會阻礙GSC發(fā)育。綜上所述，研究結(jié)果表明m5C RNA修飾在成人干細胞發(fā)育中起著重要作用。
背景：
近幾年，由于表觀轉(zhuǎn)錄組學的興起，m5C作為mRNA中除 m6A之外另一種廣泛存在的修飾，引起了研究人員們的關(guān)注。然而，其調(diào)控細胞發(fā)育和分化機制的機理目前尚不清楚。
研究材料：
室溫條件下，在標準玉米粉/糖蜜/瓊脂培養(yǎng)基上飼養(yǎng)和雜交果蠅。為最大限度提高shRNA和轉(zhuǎn)基因的表達水平，在分析卵巢表型之前，將新羽化的果蠅在29°C條件下培養(yǎng)2周。取卵巢組織分離RNA用于研究。
結(jié)果：
（1）YPS促進果蠅卵巢的GSC維持，增殖和分化
研究人員們首先發(fā)現(xiàn)YPS蛋白缺失的2周齡果蠅卵巢干細胞顯現(xiàn)出發(fā)育延遲，增值變慢的現(xiàn)象，提示該蛋白對于果蠅生殖干細胞的維持，增殖以及分化具有重要作用。由于YPS的人源同類蛋白YBX1與mRNA m5C甲基化酶NSUN2共定位于外泌體中，且YPS本身含有能夠結(jié)合核酸的保守的cold-shock結(jié)構(gòu)域，研究團隊推測YPS可能通過結(jié)合含有甲基化的mRNA來行使功能。
圖1：YPS本質(zhì)上是為了促進GSC維持、增殖和分化
（2）人YBX1可以在功能上取代YPS，促進果蠅卵巢GSC發(fā)育
為了驗證推測，研究團隊首先在YPS缺失的果蠅生殖干細胞中回補表達人源的同類蛋白YBX1，發(fā)現(xiàn)YBX1可以替代YPS促進果蠅生殖干細胞正常發(fā)育，證明兩個同源蛋白在功能上具有保守性。同時通過Flag-pulldown，免疫共沉淀以及高通量測序的方法發(fā)現(xiàn)YPS確實能在體內(nèi)結(jié)合更多含有m5C修飾的mRNA。
圖2：YPS優(yōu)先與生殖細胞中帶有m5C修飾的RNA結(jié)合
（3）YBX1-CSD主要通過疏水相互作用對帶有m5C修飾的RNA優(yōu)先結(jié)合
研究人員利用ITC以及蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析等技術(shù)，對比YBX1蛋白結(jié)合甲基化修飾的RNA以及非甲基化修飾的RNA的高分辨率復(fù)合物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在YPS和YBX1中高度保守的4個氨基酸（Trp65、Phe74、Phe85、His87）對于識別和結(jié)合甲基化修飾的RNA至關(guān)重要。其中，RNA甲基化增強了RNA與蛋白之間的疏水相互作用，確保YPS和YBX1在體內(nèi)與甲基化的RNA具有更高親和力。
圖3：果蠅YPS和人YBX1的CSD優(yōu)先與帶有m5C修飾的RNA結(jié)合
（4）RNA結(jié)合缺失突變YBX1和YPS蛋白表達嚴重打亂GSC發(fā)育
功能實驗證明，當將這些關(guān)鍵位點進行缺失突變之后，YBX1無法與RNA結(jié)合。不能結(jié)合RNA的YPS突變體W65A，F(xiàn)74A以及F85A表現(xiàn)為顯性失活，會打亂果蠅生殖干細胞的發(fā)育。結(jié)果表明，YBX1和YPS中的Trp65，Phe74和Phe85對其體內(nèi)功能至關(guān)重要。
圖4：RNA結(jié)合缺失YPS和YBX1突變的種系特異性表達嚴重干擾GSC發(fā)育
易基因小結(jié)：
本研究結(jié)果表明，YPS通過優(yōu)先識別帶有m5C修飾的RNA來調(diào)節(jié)翻譯、剪接和穩(wěn)定性，從而促進果蠅卵巢中GSC的發(fā)育，揭示了其作為mRNA m5C的結(jié)合蛋白來影響生殖干細胞發(fā)育的分子機制。同時，由于YPS/YBX家族蛋白功能從果蠅到人類都是保守的，研究驗證了人源YBX1蛋白可以替代果蠅YPS蛋白在果蠅卵巢干細胞中的作用，暗示其可能在人類干細胞中具有類似作用，果蠅卵巢或許可以分析人YBX家族蛋白和m5C修飾在生殖細胞發(fā)育中的功能，為未來的人類干細胞治療提出了可能的研究方向。
此前，易基因?qū)Π唏R魚m5C修飾在生理和病理進程中的重要調(diào)控作用、單堿基分辨率下分析人類膀胱尿路上皮癌(UCB)樣本中mRNA的m5C修飾、m5C修飾在哺乳動物mRNA出核和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用、重亞硫酸鹽處理結(jié)合高通量NGS策略，單堿基分辨率檢測人細胞(h)m5C修飾分布等m5C研究成果進行了解讀：m5C RNA甲基化測序技術(shù)---從mRNA到全轉(zhuǎn)錄組（mRNA+lncRNA+tRNA）m5C單堿基分辨檢測，期待更多m5C甲基化修飾功能調(diào)控研究成果。
關(guān)于m5C甲基化測序
易基因提供適用于不同科研需求的m5C甲基化測序技術(shù)：
- 常規(guī)mRNA m5C甲基化測序（RNA-BS）：
- 分離后首先通過亞硫酸鹽處理，非甲基化的C轉(zhuǎn)變?yōu)閁，m5C修飾的堿基保持不變，結(jié)合高通量測序，可以對RNA上的每一個C堿基修飾進行定位與定量。
- 常規(guī)mRNA +lncRNA m5C甲基化測序（lncRNA-BS）：
技術(shù)優(yōu)勢：
- 高深度：超高深度重亞硫酸鹽處理，檢測準確性極高；
- 高通量：結(jié)合高通量NGS，全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)檢測；
- 單堿基：單堿基分辨率，快速檢測和分析RNA中的m5C。
- 高準確：精確的檢測mRNA等每一個C堿基的的修飾水平。
研究方向：
- 與m6A甲基化類似，m5C甲基化已被證明與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、代謝性疾病、病毒感染以及個體發(fā)育等密切相關(guān)。
- 此外，RNA甲基化（m5C）與人類疾病密切相關(guān)，其功能涉及調(diào)控干細胞應(yīng)激、細胞毒性應(yīng)激、mRNA出核和植物細胞發(fā)育及基因表達等方面。
參考文獻：
- doi: 10.1073/pnas.1910862117.
- 南方科技大學：https://science.sustech.edu.cn/portal/Article/index?id=504&cid=10&year=2020&nav_id=95
- MeRIP-seq等揭示m6A甲基化及調(diào)控因子在食管胃結(jié)合部腺癌中的作用
- 單細胞甲基化多組學分析揭示哺乳期母體低蛋白飲食對子代的跨代傳遞
- WGBS在揭示主動DNA去甲基化缺失植物的DNA甲基化跨代增加中的應(yīng)用
- SNP分型常見問題及解決方案
- ACE等揭示產(chǎn)前不良環(huán)境暴露通過DNA羥甲基化變化介導(dǎo)子代自閉癥
- 文獻解讀：DNA甲基化保護早期胚胎線粒體基因組穩(wěn)定性
- 血液Target-BS揭示靶向DNA甲基化標記水平與患者乳腺癌風險相關(guān)
- 多組學測序分析揭示m5C甲基化上調(diào)E2F1表達以促進卵巢癌腫瘤進展
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com