hTERT 永生化腎上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法

    血管平滑肌脂肪瘤是腎臟的良性腫瘤，起源于假定的血管周圍上皮樣細(xì)胞。這些細(xì)胞可能會分化成具有黑素細(xì)胞、平滑肌或脂肪細(xì)胞特征的細(xì)胞。然而，血管平滑肌脂肪瘤的研究因缺乏成熟的血管平滑肌脂肪瘤衍生細(xì)胞系和良好的動物模型而受到限制。 hTERT 永生化腎上皮細(xì)胞來源于血管平滑肌脂肪瘤，因此研究人員現(xiàn)在可以在體外利用這些細(xì)胞的原代細(xì)胞特性和延長的壽命。

UMB1949 細(xì)胞系  表達(dá) NG2 和 L1，并且在塊蛋白 (Tsc2) 的外顯子 33 中有一個確定的 5bp 缺失，在塊蛋白（和/或錯構(gòu)蛋白）中有突變。因此，該細(xì)胞系可用于研究結(jié)節(jié)性硬化癥的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和藥物效率。SV7tert PDGFtu1細(xì)胞系來源于 SV7tert 植入裸鼠引起的腫瘤。SV7tert 細(xì)胞系是一種非致瘤性血管平滑肌脂肪瘤細(xì)胞系，通過編碼 PDGF-BB 的逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，使 SV40 大 T 抗原和人端粒酶永生化。腫瘤來源的細(xì)胞分泌的 PDGF 比植入前細(xì)胞多 18 倍，并表現(xiàn)出自分泌轉(zhuǎn)化和表觀遺傳變化。

細(xì)胞培養(yǎng)方案
用單克隆泛細(xì)胞角蛋白抗體（綠色）和 Hoechst 染料（藍(lán)色）染色的 CRL-4004。
所需材料
Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基 (DMEM)
胎牛血清
Dulbecco 磷酸鹽緩沖鹽水
胰蛋白酶-EDTA 溶液（HBSS 中的 0.25% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA）
細(xì)胞培養(yǎng)測試的 DMSO

培養(yǎng)基
hTERT 永生化腎上皮細(xì)胞可以使用加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。冷凍細(xì)胞的處理程序

和培養(yǎng)的啟動
為確保高水平的活力，解凍小瓶并在收到后盡快開始培養(yǎng)。如果到達(dá)后需要儲存冷凍培養(yǎng)物，請將小瓶儲存在液氮蒸氣中，而不是-70°C。在 -70°C 下儲存會導(dǎo)致活性喪失。
有關(guān)從每批 ATCC 腎上皮細(xì)胞中回收的活細(xì)胞總數(shù)，請參閱產(chǎn)品信息表最后一頁上提供的批次特定信息。
1可以使用配置好的完全培養(yǎng)基，如需在培養(yǎng)基中添加培養(yǎng)基添加劑需要注意保證培養(yǎng)基的PH保持在7.0-7.6之間。注意培養(yǎng)基的酸堿度變化。
2.在 37°C 水浴中輕輕攪拌解凍小瓶。為減少污染的可能性，請將 O 形圈和蓋子遠(yuǎn)離水。解凍應(yīng)該很快（大約 2 分鐘）。
3.一旦內(nèi)容物解凍并通過浸入或噴灑 70% 乙醇進(jìn)行凈化，立即將小瓶從水浴中取出。從這一點開始的所有操作都應(yīng)在嚴(yán)格的無菌條件下進(jìn)行。
4.將小瓶內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到含有 9.0 mL 完全培養(yǎng)基的離心管中，并以大約 125 xg 的速度將細(xì)胞懸浮液離心 5 至 7 分鐘。
5.棄去上清液，將細(xì)胞稀釋后在在細(xì)胞搖瓶中懸浮培養(yǎng)。
6.在 37°C、5% CO 2加濕培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)物。

細(xì)胞的傳代和維護(hù)
注意：
為避免結(jié)塊，在等待細(xì)胞分離時不要通過敲擊或搖動燒瓶來攪動細(xì)胞。置于 37°C 以促進(jìn)分散。
1.通過每 2 到 3 天更新一次培養(yǎng)基來維持培養(yǎng)中的細(xì)胞。
2.有關(guān)細(xì)胞傳代培養(yǎng)的濃度，請參閱產(chǎn)品信息表。當(dāng)確定細(xì)胞已準(zhǔn)備好進(jìn)行傳代培養(yǎng)時，繼續(xù)下一步。
3.取出并丟棄介質(zhì)。
4.用 Dulbecco 的磷酸鹽緩沖鹽水沖洗細(xì)胞以去除血清痕跡。
5.向燒瓶中加入 2.0 至 3.0 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，直至細(xì)胞層分散（通常在 5 至 10 分鐘內(nèi)）。
6.添加 6.0 至 8.0 mL 的完全生長培養(yǎng)基，并通過輕輕移液吸出細(xì)胞。
7.將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到 15 mL 離心管中，并以大約 125 xg 的速度旋轉(zhuǎn) 5 至 10 分鐘。

細(xì)胞的維護(hù)
1.丟棄上清液并在新鮮生長培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞。將適當(dāng)?shù)募?xì)胞懸浮液等分試樣添加到新的培養(yǎng)容器中。有關(guān)推薦的接種濃度，請參閱產(chǎn)品表。
2.在 37°C、5% CO 2加濕培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)物。

細(xì)胞凍存時的注意事項
可以使用已補發(fā)細(xì)胞凍存液，也可以使用95% 培養(yǎng)基+5% DMSO進(jìn)行細(xì)胞凍存。避免直接將細(xì)胞浸入液氮液相中。