單細胞轉(zhuǎn)錄組測序在小鼠大腦中的神經(jīng)炎性星形膠質(zhì)細胞亞型研究的應(yīng)用

研究結(jié)果
1. 隨著時間的推移，星形膠質(zhì)細胞獲得不同的炎癥狀態(tài)
研究星形膠質(zhì)細胞時間依賴性轉(zhuǎn)錄組對炎癥的變化，研究者在出生后第30-35天（P30-35）向Aldh1l1^eGFP報告小鼠腹腔注射LPS或無內(nèi)毒素鹽水作為對照。注射LPS后3、24和72小時，對皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞進行熒光活化細胞分選純化，提取總RNA并處理以獲得大量RNA序列（圖1a）。研究者發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞基因表達在3小時、24小時和72小時發(fā)生了廣泛變化（圖1b，c）。24小時的反應(yīng)與之前發(fā)表的反應(yīng)相似，常見的星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性標記物Gfap和Serpina3n在所有時間點都上調(diào)（圖1e）。然而，研究者發(fā)現(xiàn)，基因表達的變化大多是單個時間點獨有的（圖1d），在所有時間點，743個改變的基因中只有4%被誘導(dǎo)。例如，干擾素刺激基因（ISG）如IIgp1、Cxcl10和Gbp2在3小時時表達最高（圖1e、f）。在24小時，參與血管生成和血壓的基因如Fbln5、Agt和參與細胞外基質(zhì)重塑的基因（包括Timp1）上調(diào)（圖1e、f）。
 

2. 復(fù)雜的星形細胞亞群分布在大腦中不同的區(qū)域
為了進一步了解星形膠質(zhì)細胞的異質(zhì)性，研究者接下來對來自注射LPS和鹽水的雄性和雌性Aldh1l1^eGFP小鼠的星形膠質(zhì)細胞進行scRNA-seq（圖2a）。使用細胞類型標記去除非星形細胞后，共保留79,944個細胞，鑒定到10個細胞類群(圖2b,c)，這些亞群可分為灰質(zhì)/上層富集(亞群0、1、3和8)或白質(zhì)/深層/次皮層(亞群 2、4、5、6、7和9)。為了確定研究者的星形膠質(zhì)細胞亞群是否占據(jù)不同的解剖位置，研究者對3只鹽水處理小鼠和3只LPS處理小鼠大腦切片進行了空間轉(zhuǎn)錄組分析。通過星形膠質(zhì)細胞特異性基因，如S100b或Aldh1l1的空間表達，結(jié)合單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，確定了各細胞群的空間位置。 
 

3. 星形膠質(zhì)細胞對炎癥的反應(yīng)是異質(zhì)性的
為了了解單個集群對LPS誘導(dǎo)的炎癥的反應(yīng)，研究者對各個亞群分別進行了差異分析。研究者觀察到，所有集群對LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)強烈（圖3b-d）。盡管大多數(shù)星形膠質(zhì)細胞表現(xiàn)出重疊的基因誘導(dǎo)，但不同的亞群產(chǎn)生不同的炎癥反應(yīng)（圖3c、d）。研究者發(fā)現(xiàn)每個亞群都有獨特的誘導(dǎo)基因，其中亞群4具有最多的亞群特異性DEG（圖3c）。然而，大多數(shù)基因在集群之間表現(xiàn)出復(fù)雜的協(xié)同調(diào)節(jié)，在9個集群中常見45個DEG（圖3c）。當(dāng)觀察LPS誘導(dǎo)基因的亞群富集時，研究者再次觀察到炎癥基因的亞群特異性表達。例如，亞群8富含ISG，如Igtp、Tap1和Stat1。同時，亞群7誘導(dǎo)參與血管生成的基因，包括Agt、Cd34、Fbln5和Pgf。
 

4. 星形膠質(zhì)細胞的反應(yīng)亞群占據(jù)不同的解剖位置
亞群4占所有測序星形膠質(zhì)細胞的5.9%，主要由炎癥標記物定義，包括Timp1、Gap43、Hspb1、Lcn2和Gfap。亞群4還表達通常由干擾素誘導(dǎo)的基因，包括Psmb8、Ifitm3和參與抗原呈遞的基因：H2-K1、H2-T23和H2-D1（圖4a–c）。研究者發(fā)現(xiàn)，在鹽水和LPS處理的動物中，第4亞群細胞存在于Gfap+白質(zhì)束中，包括胼胝體，以及第三腦室和側(cè)腦室之間（圖2d和4d）。盡管亞群4在對照和炎癥小鼠大腦中被鑒定，受LPS誘導(dǎo)表達上述炎癥基因（圖3）。當(dāng)探測亞群4基因模塊時，研究者發(fā)現(xiàn)LPS處理在所有Visium腦切片中都有強大的誘導(dǎo)作用（圖4e）。
 

與亞群4不同，亞群8對LPS表現(xiàn)出強烈的早期反應(yīng)，是唯一一個幾乎完全存在于LPS處理的小鼠中的亞群（圖第5a、d）。亞群8表達的基因中的大多數(shù)是ISG，包括IFN依賴性轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)節(jié)因子Stat1和Stat2。在亞群8中富集的其他基因包括參與抗原處理（Tap1和Tap2）和呈遞（H2-Q4、H2-K1、H2-Ab1、H2-D1和H2-T23）以及IFN誘導(dǎo)的GTP酶（Gbp3、Gbp7、Gbp2、Irgm1、Iigp1和Igtp）的基因（圖5b、c），提示這些星形膠質(zhì)細胞暴露于干擾素，并使其抗原呈遞能力增加�？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)顯示Cluster 8位于小鼠大腦的側(cè)腦室和第三腦室周圍、海馬下方以及腦表面。
 

5. 疾病模型中的干擾素反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞
鑒于其明確的炎癥特征，在明確炎癥特征的基礎(chǔ)上，研究者將本文的研究數(shù)據(jù)與前人發(fā)表的來自阿爾茨海默病小鼠模型、多發(fā)性硬化(MS)小鼠模型和急性刺傷模型的scRNA-seq數(shù)據(jù)集整合在一起分析，以期進一步探討亞群8是否存在于其他具有炎癥成分的疾病模型中。以上數(shù)據(jù)集單獨分析時，沒有發(fā)現(xiàn)8亞群星形膠質(zhì)細胞，可能是因為這些研究中亞群8星形膠質(zhì)細胞的占比較低(~2.7%)。而當(dāng)所有數(shù)據(jù)集整合分析時，在人類疾病的慢性小鼠模型中，研究者發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞表達亞群8基因，其表達部分依賴于Trem2（圖6a–c）。最后，在刺傷損傷的小鼠模型中也可以發(fā)現(xiàn)第亞群8星形膠質(zhì)細胞（圖6g–i）。這些整合實驗提供了一種可能性，即盡管星形膠質(zhì)細胞在單一損傷（例如LPS誘導(dǎo)的炎癥）內(nèi)的反應(yīng)存在異質(zhì)性，但在幾種條件下，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞的特定亞狀態(tài)存在一定的同質(zhì)性。
 

參考文獻：
Hasel, P., Rose, I. V. L., Sadick, J. S., Kim, R. D., & Liddelow, S. A. (2021). Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain. Nature neuroscience, 24(10), 1475–1487. https://doi.org/10.1038/s41593-021-00905-6