代謝組學(xué)應(yīng)用：普洱茶和茶褐素通過(guò)“菌-腸-肝-腦”軸緩解代謝綜合征

近日，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院龔加順教授團(tuán)隊(duì)與上海百趣代謝組學(xué)技術(shù)研究中心團(tuán)隊(duì)在Food Research International（IF=7.425）上發(fā)表了題為“Pu-erh Tea and Theabrownin Ameliorate Metabolic Syndrome in Mice via Potential Microbiota-Gut-Liver-Brain Interactions”的論文。
 

圖1. 研究?jī)?nèi)容要點(diǎn)

研究結(jié)果
1.普洱茶和茶褐素干預(yù)改善MS小鼠體重和炎癥及衰老等指標(biāo)的變化干預(yù)期間，K組和K各干預(yù)組間及MS組和MS各干預(yù)組間小鼠的飲食量和飲水量無(wú)顯著變化，但K組和K各干預(yù)組小鼠的體重和飲水量顯著低于MS組和MS各干預(yù)組。同時(shí)，ME組小鼠體重降低最多，但飲食量最多、飲水量較少。 與K組相比，MS組的胰腺重量顯著降低，肝臟和脂肪組織重量顯著升高，普洱茶和茶褐素干預(yù)能從一定程度上緩解MS引起的變化。此外，結(jié)合脂肪組織切片和脂滴面積，發(fā)現(xiàn)普洱茶在緩解體重增加和提高脂質(zhì)代謝方面可能比茶褐素效果更好。

肝組織和空腸的病理切片表明普洱茶和茶褐素能有效緩解肝組織和空腸的損傷和炎癥的發(fā)生；肝組織炎癥指標(biāo)（IL-1、IL-6和TNF-6），抗氧化指標(biāo)（SOD和GSH），氧化指標(biāo)（MDA）、胰島素INS和血糖glucose指標(biāo)分析結(jié)果表明，MS組的炎癥指標(biāo)顯著升高，而二甲酸胍和茶褐素能顯著地改善炎癥因子的異常；MDA在MS小鼠顯著升高，SOD和GSH在MS小鼠中顯著降低，二甲酸胍和茶褐素菌同樣能顯著地緩解這些指標(biāo)的異常；INS在MS小鼠中顯著降低，glucose在MS小鼠中顯著升高，二甲酸胍和茶褐素能顯著改善INS的變化，但并不改變glucose的變化。綜上，茶褐素在改善MS相關(guān)的炎癥因子、氧化和抗氧化能力等指標(biāo)方面可能比普洱茶效果更好。
 

圖2. 普洱茶和茶褐素干預(yù)對(duì)小鼠生理生化、炎癥及衰老指標(biāo)的影響

2.普洱茶和茶褐素干預(yù)改善MS小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成各組不同時(shí)間點(diǎn)的腸道菌群結(jié)果表明，小鼠在經(jīng)歷正常飲食模式切換到高脂飲食模式后，菌群α多樣性出現(xiàn)降低，β多樣性出現(xiàn)升高。 從PCoA（principal co-ordinates analysis）圖能明顯看出不同干預(yù)對(duì)小鼠腸道菌群組成的變化軌跡，飲食模式切換對(duì)菌群的影響十分明顯。此外，各組不同時(shí)間點(diǎn)的菌群組成結(jié)果表明高脂飲食后，F(xiàn)irmicutes/Bacteroides，Proteobacteria和Verrucomicrobia顯著升高。

接下來(lái)，對(duì)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)的菌群數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，與K組及其干預(yù)組相比，MS組及干預(yù)組小鼠有更低的Firmicutes和更高的與產(chǎn)脂多糖和炎癥相關(guān)菌Proteobacteria；MY組中的Bacteroides最高；KE組和KB組相對(duì)于K組α多樣性顯著增高，而MS組各干預(yù)組相對(duì)于MS組未發(fā)生顯著變化；從PCoA和NMDS（Non-Metric Multidimensional Scaling）分析明顯看出MS干預(yù)組更趨向于K，由此可看出普洱茶、茶褐素和二甲酸胍干預(yù)能夠調(diào)控改善MS小鼠腸道菌群。

為進(jìn)一步探索與普洱茶和茶褐素干預(yù)相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)菌，結(jié)合時(shí)間序列l(wèi)mer分析、MetaStats和Wilcoxon統(tǒng)計(jì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)相對(duì)K組，K組各干預(yù)組中有3個(gè)顯著升高的細(xì)菌（Brevundimonas vesicularis, Veillonella parvula, Cutibacterium acnes ）和3個(gè)顯著降低的細(xì)菌（Blautia coccoides, Desulfovibrio sp UNSW3caefatS, Firmicutes bacterium ASF500）；此外，相對(duì)MS組，在MS干預(yù)組中有抗炎作用的產(chǎn)短酸菌Clostridiales bacterium42_27和有抗炎和抗增重效果的Firmicutes bacterium ASF500顯著升高。

PICRUSt功能分析表明，普洱茶和茶褐素干預(yù)的MS小鼠組中，腸道菌群的功能層面上無(wú)顯著影響，但普洱茶和茶褐素干預(yù)的K小鼠組中，腸道菌群參與的氨基酸和脂質(zhì)代謝功能發(fā)生明顯變化。 綜上，普洱茶和茶褐素能夠通過(guò)調(diào)控腸道菌群進(jìn)而減少炎癥從而緩解代謝綜合征，而且普洱茶和茶褐素對(duì)正常小鼠和代謝綜合征小鼠的腸道菌群的調(diào)控是有差異的，表明對(duì)代謝綜合征進(jìn)行菌群調(diào)節(jié)的時(shí)候需要考慮飲食背景。
 

圖3. 普洱茶和茶褐素干預(yù)對(duì)小鼠腸道菌群的影響

3.普洱茶和茶褐素干預(yù)影響MS小鼠肝臟節(jié)律基因表達(dá)為進(jìn)一步探究普洱茶和茶褐素干預(yù)代謝綜合征MS小鼠的潛在分子作用機(jī)制，對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè)分析，累計(jì)發(fā)現(xiàn)5252個(gè)差異基因；對(duì)差異基因進(jìn)行SPIA（Signaling-pathway impact analysis）通路富集分析發(fā)現(xiàn)，節(jié)律基因相關(guān)的通路在普洱茶和茶褐素干預(yù)小鼠肝臟中呈現(xiàn)顯著變化，其中Npas2, Clock, Arntl和Cry1等節(jié)律基因在MS組及普洱茶和茶褐素干預(yù)MS組中均發(fā)生顯著變化。 相對(duì)普洱茶干預(yù)MS小鼠，茶褐素干預(yù)會(huì)影響調(diào)控更多與節(jié)律基因通路相關(guān)的基因（如Npas2, Clock, Arntl, Cry1, Per3, Per2和Bhlhe40等）。
 

圖4. 普洱茶和茶褐素干預(yù)對(duì)小鼠肝臟基因表達(dá)的影響

4.普洱茶和茶褐素干預(yù)影響MS小鼠血清和腦組織脂質(zhì)代謝對(duì)小鼠的血清和腦組織進(jìn)行LC-MS/MS非靶標(biāo)代謝學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)K組，MS組及各自干預(yù)組的血清和腦組織樣本中代謝輪廓譜出現(xiàn)顯著變化，從血清和腦組織代謝組數(shù)據(jù)中分別找到259個(gè)和149個(gè)差異代謝物。 差異代謝物的MetPA（ Metabolomics Pathway Analysis）通路分析表明，普洱茶和茶褐素可顯著調(diào)節(jié)正常小鼠血清和腦組織甘油磷脂代謝和亞油酸代謝；普洱茶可顯著干預(yù)MS小鼠血清中的甘油磷脂代謝和亞油酸代謝，而茶褐素的干預(yù)作用恰好相反，茶褐素顯著影響的是MS小鼠腦組織中甘油磷脂代謝和亞油酸代謝。此外，普洱茶、茶褐素和二甲雙胍還顯著影響了MS小鼠腦組織中的嘌呤代謝。
 

圖5. 普洱茶和茶褐素干預(yù)對(duì)小鼠血清和腦組織代謝的影響05關(guān)聯(lián)分析探索研究普洱茶和茶褐素干預(yù)緩解MS的潛在機(jī)制

為進(jìn)一步探索潛在作用機(jī)制，首先以差異腸道細(xì)菌、差異肝臟基因、差異血清和腦組織代謝物進(jìn)行rdcv-PLS（partial least square-discriminant analysis incorporated into a repeated double cross-validations framework）關(guān)聯(lián)分析，以|皮爾森相關(guān)系數(shù)|>0.6為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出了19個(gè)腸道細(xì)菌，81個(gè)肝臟基因，71個(gè)血清和32個(gè)腦組織代謝物，從PCA（principal component analysis）圖可看出這些篩選出的關(guān)鍵指標(biāo)能夠較好地區(qū)分各組。

與前面腸道菌群結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的7個(gè)關(guān)鍵細(xì)菌進(jìn)行取交集，可以發(fā)現(xiàn)，rdcv-PLS模型篩選出了6個(gè)關(guān)鍵細(xì)菌，在普洱茶和茶褐素干預(yù)MS小鼠中，這6個(gè)關(guān)鍵細(xì)菌（C. bacterium 42_27, F. bacterium ASF500, B. coccoides, B. vesicularis, C. acnes, D. sp. UNSW3caefatS）與肝臟節(jié)律基因（如npas2, nr1d1, cry2, per3, arntl等）有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)，且這些節(jié)律基因與脂質(zhì)、氨基酸和嘌呤代謝相關(guān)的代謝物（如N, N-dimethylglycine, deoxyguanosine, deoxycholic acid(+), beta-guanidinopropionic acid, 12-hydroxydodecanoic acid等）顯著相關(guān)。
 

圖6. rdcv-PLS模型篩選出的關(guān)鍵變量

為研究關(guān)鍵細(xì)菌與基因和代謝物指標(biāo)及炎癥和衰老指標(biāo)的關(guān)系，接下來(lái)對(duì)上述篩選得到的各項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行spearman相關(guān)性分析。結(jié)果表明，MS和ME組中，C. acnes與腦組織代謝物decanoic acid顯著負(fù)相關(guān)，而與Clock、Npas2、MDA和IL-1正相關(guān)；C. bacterium 42_27與腦組織代謝物decanoic acid顯著正相關(guān)，與Clock顯著負(fù)相關(guān)。

MS和MB組中，F(xiàn). bacterium ASF500與血清代謝物3-dehydroxycarnitine和腦組織代謝物decanoic acid及Slc16a3, MDA, and IL-6顯著負(fù)相關(guān)；與血清代謝物（如2-arachidonyl glycerol ether, 2-deoxyycastasterone, succinic acid semialdehyde），腦組織lysoPI（18:0/0:0）, Cry1, Cry2, Per2, Per3, Slc16a7,和INS顯著正相關(guān)；B. coccoides與Slc5a8, IL-6和TNF-α顯著負(fù)相關(guān)，與血清代謝物DG（18:3（9Z,12Z,15Z）/15:0/0:0），腦組織代謝物L(fēng)ysoPI（18:0/0:0），Per3, Olfr78和INS顯著正相關(guān)；C. bacterium 42_27與血清代謝物linoelaidic acid, Clock, Npas2和IL-1,與血清脂質(zhì)PC（P-18:1（9Z）/16:1（9Z），2-arachidonyl glycerol ether, deoxycholic acid(-)和deoxycholic acid(+)顯著正相關(guān)。

因此，普洱茶和茶褐素干預(yù)MS小鼠中，腸道菌群可能通過(guò)影響肝臟節(jié)律基因、短酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因和短酸受體基因間的相互作用來(lái)調(diào)控改善代謝綜合征，推測(cè)短鏈脂肪酸代謝可能是普洱茶或茶褐素影響腸道菌群的潛在靶點(diǎn)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證上述推測(cè)，對(duì)小鼠糞便樣本中的短鏈脂肪酸進(jìn)行檢測(cè)；從分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與肥胖相關(guān)的短鏈脂肪酸（acetic acid和propionic acid）和潛在有害短鏈脂肪酸（isobutyric acid和isovaleric acid）在普洱茶干預(yù)的MS小鼠組中顯著降低，在茶褐素干預(yù)的MS小鼠中非顯著降低。 綜上，茶褐素和普洱茶可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群、短鏈脂肪酸代謝、血清和腦組織脂質(zhì)代謝、肝臟中的炎癥和衰老因子及晝夜節(jié)律基因表達(dá)來(lái)有效緩解代謝綜合征。
 

圖7. 關(guān)鍵變量間的相關(guān)性及普洱茶和茶褐素干預(yù)對(duì)小鼠短鏈脂肪酸的影響

結(jié)論
本研究以高脂飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征小鼠為研究對(duì)象，首次聯(lián)合多組學(xué)技術(shù)（16S rRNA測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組、LC-MS/MS非靶標(biāo)代謝組和GC-MS靶標(biāo)代謝組等）對(duì)普洱茶和茶褐素緩解代謝綜合征的潛在機(jī)制進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)普洱茶和茶褐素可能通過(guò)“菌-腸-肝-腦”軸（腸道菌群-糞便短鏈脂肪酸代謝-血清和腦組織脂質(zhì)代謝-肝臟炎癥和衰老因子及晝夜節(jié)律基因）來(lái)改善代謝綜合征；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了普洱茶和茶褐素干預(yù)在改善代謝綜合征的效果及潛在靶點(diǎn)上具有一定的差異。本研究結(jié)果為普洱茶益生菌相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)，為普洱茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了科技理論支撐。