細胞攻略：A-375(人惡性黑色素瘤細胞)細胞培養(yǎng)教程

細 胞 基 本 信 息
細胞正常生長形態(tài)

細胞名稱: A-375(人惡性黑色素瘤細胞)
細胞別稱: A 375; A375; A375-MEL; A375-mel; A375mel
細胞貨號: SNL-065
生長特性: 貼壁
培養(yǎng)條件: DMEM+10% FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境: 空氣，95%；二氧化碳 (CO2)，5%
細胞簡介: A-375細胞源自患有惡性黑色素瘤的女性患者的皮膚，是由D·J·Giard等人建立的一系列細胞株中的一株。A-375細胞在抗胸腺細胞球蛋白、血清處理的NIH瑞士小鼠中形成類似于惡性黑素瘤的快速增長的皮下腫瘤，A-375細胞可以在普通成纖維細胞飼養(yǎng)層和瓊脂上形成克隆。A-375細胞是NRAS mutant-A375 isogenic理想對照，可用于3D細胞培養(yǎng)、高通量篩選、毒理學和免疫腫瘤學研究，也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。

A-375（人惡性黑色素瘤細胞）特點
 
01細胞顆粒感較重
細胞傳代培養(yǎng)時細胞內(nèi)黑點及細胞外顆粒較多，建議使用優(yōu)質(zhì)血清及培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞；
02傳代、復蘇注意細胞狀態(tài)
細胞消化或者復蘇操作不當容易導致細胞死亡裂解產(chǎn)生大量碎片及顆粒，進而影響活細胞狀態(tài)，注意消化或復蘇過程盡量輕柔，嚴格控制消化時間和復蘇操作規(guī)范，傳代或復蘇24h后建議觀察細胞，建議換液一次去除死亡細胞；

細 胞 收 貨 攻 略

常溫細胞
1.T25瓶收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養(yǎng)箱靜置2-4h；
2.吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 ml，顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片，觀察細胞密度，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（首次傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 ml繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度80%以上再進行傳代培養(yǎng)；
 
凍存細胞
 
1.細胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰完全揮發(fā)建議立即復蘇細胞并聯(lián)系銷售人員解決；
 
2.凍存細胞建議盡快復蘇一管培養(yǎng)檢查，以免超出售后期，復蘇步驟參考復蘇攻略；
 
3.復蘇一管細胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術(shù)支持的指導下進行下一步操作；
 
Tips：
1.細胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完全揮發(fā)等異常情況時，及時拍照聯(lián)系銷售人員；
 
2.該細胞貼壁生長，一般T25瓶運輸過程中較少出現(xiàn)大量細胞脫落并聚團的情況，少量細胞脫落是正常狀態(tài)，不影響細胞生長，按正常操作步驟繼續(xù)培養(yǎng)即可。
 
3.尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內(nèi)含對應(yīng)細胞的完全培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續(xù)細胞培養(yǎng)；

細 胞 傳 代 攻 略
 
 1.先盡量吸干凈T25瓶原培養(yǎng)基，再加3-4ml 常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20s，吸走潤洗的PBS；
 
2. T25瓶加1ml左右胰酶，輕輕晃動培養(yǎng)瓶以使胰酶鋪勻瓶底細胞層，將培養(yǎng)瓶放入37度培養(yǎng)箱消化；
  
3.消化到細胞間隙變大，但未完全脫落時加2-3ml完全培養(yǎng)基終止胰酶消化；
 
 4.混勻細胞，900rpm離心3-5min，棄上清；
 
5.加新的完全培養(yǎng)基輕輕重懸細胞，均勻分到新的培養(yǎng)瓶里，補足完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；
 
Tips：
1.對于消化細胞程度，客戶如果經(jīng)驗不多，無法準確掌控胰酶作用時間，建議客戶按照下述操作：胰酶首先復溫到室溫后加入細胞，放入37度培養(yǎng)箱，然后每隔30秒，即吹打下細胞（此時吹打細胞應(yīng)盡量輕柔，不能強行將細胞吹下，否則細胞可能出現(xiàn)機械損傷），如果能夠吹打散細胞，說明細胞消化完成可以終止消化，如果30秒吹打不下，再等30秒重復操作直至能夠輕柔的吹下細胞；
 
2. T25瓶加10-12ml完全培養(yǎng)基，10cm皿加12-15ml，2-3天換液一次。
 
3. 細胞收貨后首次傳代建議按1：2傳代，后續(xù)培養(yǎng)可以視具體細胞生長狀態(tài)和密度情況決定傳代比例；
傳代后24h建議觀察細胞并換液一次去除死亡細胞；

細胞 凍 存 攻 略
 
凍存步驟
 
1.先將細胞按傳代步驟消化、離心，至傳代步驟4，棄細胞上清，獲得細胞沉淀；
 
2.加入適量預(yù)先配好的程序性凍存液輕輕重懸細胞，并將細胞懸液轉(zhuǎn)移至做好標記的凍存管中；
 
3.將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；
4.轉(zhuǎn)移細胞至液氮保存并登記細胞保存位置，液氮保存24h后建議復蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長期保存，若低于80%建議重新凍存；
 
Tips：
1.檢測凍存細胞活性結(jié)果未合格前，培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞建議繼續(xù)培養(yǎng)直至確認凍存合格方可視需要丟棄；
 
2.程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液可以按產(chǎn)品說明書處理降溫過程；
 
3.T25培養(yǎng)瓶長滿通常可以凍存2-3管，10cm皿長滿可以凍存3-4管；
 
細 胞 復 蘇 攻 略
 
復蘇步驟
1.將所需的完全培養(yǎng)基放在培養(yǎng)箱預(yù)熱30min后開始復蘇；
2.準備37度溫水，將細胞從液氮罐取中出，觀察管內(nèi)無液氮的情況下，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入溫水輕輕搖晃，融化至米粒大小冰塊，終止水��；
 
3.將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心1-2min，不同離心機具體轉(zhuǎn)速會有差異；
4.離心完成后，棄凍存液，用剛才預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，并輕柔重懸細胞后接種至T25或者10cm皿中。
 
Tips：
1.凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細胞時震動不要過大，水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮建議靜置一會待液氮完全蒸發(fā)后再水��；
 
2.水浴時可以使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，可以降低管蓋縫隙滲入水導致污染的概率；
 
3.水浴至剩米粒大小時及時終止水浴，避免過度水浴或水浴時間不足；
 
4.建議水浴完成后直接在離心管內(nèi)離心細胞，避免再次轉(zhuǎn)移細胞；
 
5.復蘇后的細胞比較脆弱，吹打和轉(zhuǎn)移細胞時盡量輕柔，復蘇24h后換液去除死亡細胞；
 
常見問題及解決方案

NO.1細胞密度怎么計算的？
嚴格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數(shù)細胞數(shù)量，但在實際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細胞數(shù)量而消化細胞計數(shù)。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導致并不嚴謹，但也是相當直觀、簡便的表現(xiàn)細胞狀態(tài)的一種方式；
 
NO.2培養(yǎng)過程中細胞碎片較多怎么處理？
1. 細胞內(nèi)的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現(xiàn)象，只是不同細胞顆粒多少有區(qū)別，細胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。
 
2.細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞，消化完成后加完全培養(yǎng)基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細胞，再離心后，用完全培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。
 
NO.3細胞具體消化時間是多久？
每個客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能完全規(guī)定消化時間，以實際消化效果和客戶經(jīng)驗為準。 
 
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