細(xì)胞攻略：Hi-five(昆蟲細(xì)胞)細(xì)胞培養(yǎng)教程

   
細(xì)胞名稱：Hi-five(昆蟲細(xì)胞)
細(xì)胞別稱： BTI-Tn-5B1-4；BTI-TN-5B1-4; BTI-TN5B1-4; BTI-Tn5B14; BTI-Tn 5B1-4; Tn-5B1-4; Tn 5B1-4; Tn5 B1-4; Tn5B1-4; TN5B14; TnH5; High Five; High 5; High-5; High5; Hi-5; Hi5; Tn-5
細(xì)胞貨號： SNL-191
生長特性： 半貼壁
培養(yǎng)條件： Grace's Insect Medium（Supplemented）+10%FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境：空氣，100%；
細(xì)胞簡介： Hi-five(BTI-TN-5B1-4)細(xì)胞是由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院胡遠(yuǎn)揚(yáng)教授提交保藏。Hi-five(BTI-TN-5B1-4)細(xì)胞是一株昆蟲細(xì)胞，主要用于昆蟲病毒的擴(kuò)增、病毒與宿主細(xì)胞相互作用的研究等。
 
   
1、細(xì)胞靜置培養(yǎng)時半貼壁生長，也可以使用搖瓶懸浮培養(yǎng)
靜置培養(yǎng)時細(xì)胞會大量附著瓶底生長，呈半貼壁狀態(tài)，會有少部分細(xì)胞懸浮生長；
搖瓶培養(yǎng)時可以很快適應(yīng)懸浮生長，呈單個或小聚團(tuán)懸浮生長；
 
2、對溫度極為敏感
細(xì)胞于26-28℃空氣培養(yǎng)，需要盡量控制溫度，保證細(xì)胞生長狀態(tài)；
若溫度低于26℃，細(xì)胞生長速度會變慢，但恢復(fù)溫度后生長速度會逐漸恢復(fù)，不會對細(xì)胞產(chǎn)生過大傷害；
若溫度28℃-30℃，細(xì)胞生長嚴(yán)重受限；若溫度高于30℃，細(xì)胞將受不可逆?zhèn)�害�?dǎo)致無法使用，即使溫度恢復(fù)也無法恢復(fù)正常生長狀態(tài)；
同時注意使用的培養(yǎng)基、PBS及其他試劑應(yīng)復(fù)溫至室溫（最好26-28℃），盡量減少觀察細(xì)胞次數(shù)和時間；
 
3、細(xì)胞對吹打、氣泡等機(jī)械損傷敏感
細(xì)胞操作時若吹打力度過大、氣泡過多將嚴(yán)重影響細(xì)胞生長狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞后續(xù)存活率降低，注意操作輕柔；
 
4、細(xì)胞可以適應(yīng)多種培養(yǎng)體系
該細(xì)胞多用于真核細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)，因此針對該細(xì)胞有諸多培養(yǎng)體系，例如Grace's Insect Medium、SF900 II、TNM-FH、ESF921等培養(yǎng)體系，包括含血清的培養(yǎng)體系和不含血清的培養(yǎng)體系，可以根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)需要選擇逐步更換為合適的培養(yǎng)體系；
 
5、細(xì)胞對吹打、氣泡等機(jī)械損傷敏感
細(xì)胞操作時若吹打力度過大、氣泡過多將嚴(yán)重影響細(xì)胞生長狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞后續(xù)存活率降低，注意操作輕柔；
 
 6、細(xì)胞凍存存活率不高
實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中，尚恩發(fā)現(xiàn)Hi-five細(xì)胞疑似表現(xiàn)出較低的凍存保存能力，凍存后活率會隨保存時間增加而逐漸下降，因此若有持續(xù)培養(yǎng)該細(xì)胞或者需要快速復(fù)蘇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)需求的實(shí)驗(yàn)室建議定期復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞并重新凍存以保證細(xì)胞凍存活性不會下降至無法接受的范圍；
 
7、細(xì)胞貼壁培養(yǎng)后可能會伸出觸角
細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)時，一周左右會有部分細(xì)胞伸出較長觸角，同一個培養(yǎng)瓶培養(yǎng)時間越長，有觸角的細(xì)胞可能越多，這是細(xì)胞自然現(xiàn)象，非細(xì)胞交叉污染或狀態(tài)不佳；
 
   
常溫細(xì)胞
1.T25瓶收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放28℃培養(yǎng)箱靜置2-4h；
2.吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 ml，顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片，觀察細(xì)胞密度，若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代（傳代比例建議1：2），若細(xì)胞密度低于70%可以留10-12 ml繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

凍存細(xì)胞
1.細(xì)胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復(fù)蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決；
2.凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查，以免超出售后期，復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略；
3.復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進(jìn)行下一步操作；
 
Tips
1.細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰揮發(fā)等異常情況時，及時拍照聯(lián)系銷售人員；
2.該細(xì)胞貼壁生長，一般T25瓶運(yùn)輸過程中較少出現(xiàn)大量細(xì)胞脫落并聚團(tuán)的情況，少量細(xì)胞脫落是正常狀態(tài)，不影響細(xì)胞生長，按正常操作步驟繼續(xù)培養(yǎng)即可。
3.尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對應(yīng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)；
 
   
1.輕輕拍打培養(yǎng)瓶背面，使細(xì)胞松動，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)基輕輕吹打細(xì)胞面使細(xì)胞脫落，少量未脫落的細(xì)胞可以留著繼續(xù)培養(yǎng)；
2.收集細(xì)胞懸液，混勻細(xì)胞，900rpm離心3-5min，棄上清；
3.加3-5ml PBS重懸細(xì)胞，再次混勻細(xì)胞，900rpm離心3-5min，棄上清；
4.加新的培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞，均勻分到新的培養(yǎng)瓶里，補(bǔ)足培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；
 
Tips
1. 注意操作輕柔，盡量降低吹打力度、避免產(chǎn)生氣泡；
2. T25瓶加10-12ml培養(yǎng)基，10cm皿加12-15ml，30%密度4-5天換液一次，30-50%密度3-4天換液一次，50-80%密度2-3天換液一次，80%以上每天換液；
3. 細(xì)胞收貨后傳代建議按1：2傳代，后續(xù)培養(yǎng)可以視具體細(xì)胞生長狀態(tài)和密度情況決定傳代比例；
4. 傳代后24h建議觀察細(xì)胞并換液一次去除死亡細(xì)胞；
 
   
凍存步驟
1.先將細(xì)胞按傳代步驟收集離心，至傳代步驟3，棄細(xì)胞上清，獲得細(xì)胞沉淀；
2.加入適量預(yù)先配好的程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至做好標(biāo)記的凍存管中；
3.將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；
4.轉(zhuǎn)移細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置，液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測凍存細(xì)胞的活性，若活性合格即可長期保存，若低于80%建議重新凍存；
 
Tips
1.檢測凍存細(xì)胞活性結(jié)果未合格前，培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞建議繼續(xù)培養(yǎng)直至確認(rèn)凍存合格方可視需要丟棄；
2.程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液可以按產(chǎn)品說明書處理降溫過程；
3.T25培養(yǎng)瓶長滿通�？梢詢龃�2-3管，10cm皿長滿可以凍存3-4管；
 
   
復(fù)蘇步驟
1.將所需的培養(yǎng)基放在培養(yǎng)箱預(yù)熱30min后開始復(fù)蘇；
2.準(zhǔn)備37度溫水，將細(xì)胞從液氮罐取中出，觀察管內(nèi)無液氮的情況下，捏住管蓋，將細(xì)胞凍存部分浸入溫水輕輕搖晃，融化至米粒大小冰塊，終止水浴；
3.將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心1-2min，不同離心機(jī)具體轉(zhuǎn)速會有差異；
4.離心完成后棄凍存液，用剛才預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，并輕柔重懸細(xì)胞后接種至T25或者10cm皿中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱；
5.24h后觀察細(xì)胞并換液一次，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；

Tips
1.凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細(xì)胞時震動不要過大，水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮建議靜置一會待液氮蒸發(fā)后再水��；
2.水浴時可以使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，可以降低管蓋縫隙滲入水導(dǎo)致污染的概率；
3.水浴至剩米粒大小時及時終止水浴，避免過度水浴或水浴時間不足；
4.建議水浴完成后直接在離心管內(nèi)離心細(xì)胞，避免再次轉(zhuǎn)移細(xì)胞；
5.復(fù)蘇后的細(xì)胞比較脆弱，吹打和轉(zhuǎn)移細(xì)胞時盡量輕柔，復(fù)蘇24h后換液去除死亡細(xì)胞；
 
  1、細(xì)胞密度怎么計(jì)算的？
嚴(yán)格意義上，細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，但在實(shí)際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計(jì)數(shù)。因此，常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個細(xì)胞生長不同密度時所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn)，但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式；
 
NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理？
1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，這個屬于細(xì)胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細(xì)胞都會有這種現(xiàn)象，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞，消化完成后加培養(yǎng)基終止消化，混勻細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細(xì)胞，再離心后，用培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

NO.3懸浮培養(yǎng)需要怎么操作？
本公司Hi-five細(xì)胞自適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，基本無需訓(xùn)化。 需要懸浮培養(yǎng)前需保證細(xì)胞活性90%以上，收集細(xì)胞懸液，以1x10⁷細(xì)胞/ml的密度接種至搖瓶中培養(yǎng)即可。搖瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)速跟實(shí)際條件相關(guān)，尚恩使用轉(zhuǎn)速約100rpm/min，客戶可以根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)室情況選擇合適的轉(zhuǎn)速（通常80-150rpm之間）。
 
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【SNLM-191】 Hi-five細(xì)胞專用培養(yǎng)基