蛋白冠蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在實(shí)現(xiàn)快速深入精確解析血漿蛋白質(zhì)圖譜中的應(yīng)用

文章標(biāo)題：Rapid, deep and precise profiling of the plasma proteome with multi-nanoparticle protein corona
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：17.694
作者單位：哈佛醫(yī)學(xué)院；Seer，美國（百趣生物蛋白冠™蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研發(fā)單位）

研究背景
血漿蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性限制了大規(guī)模、無偏的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。該研究報(bào)道了一種可拓展、高效的蛋白質(zhì)鑒定和定量平臺(tái)——蛋白冠技術(shù)，利用納米顆粒(nanoparticles, NPs)獨(dú)特的表面物化特性，可與蛋白組進(jìn)行獨(dú)特的相互作用形成蛋白冠，從而實(shí)現(xiàn)血漿蛋白質(zhì)組的深度檢測。在一項(xiàng)關(guān)于非小細(xì)胞肺癌的分類實(shí)驗(yàn)中，通過5個(gè)NPs聯(lián)用，在141個(gè)血漿樣本中檢測出2000多種蛋白質(zhì)。本文所描述的技術(shù)即通過蛋白質(zhì)和NPs之間獨(dú)特的相互作用，結(jié)合精簡的工作流程，使得高深度、廣覆蓋的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究成為現(xiàn)實(shí)。
 

圖1. 蛋白冠技術(shù)工作流程研究結(jié)果

1.NPs開發(fā)與表征
在蛋白冠的基礎(chǔ)研究中，開發(fā)了超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIONs, NP)，可以用于蛋白冠的自動(dòng)化檢測。粒子的超順磁性核心促進(jìn)蛋白冠與血漿的快速磁分離（<30秒），大大減少了LC-MS/MS提取NP蛋白冠所需的時(shí)間。 ，此外，不同的表面修飾，也有助于SPIONs產(chǎn)生不同的冠狀物模式，以更廣泛地研究蛋白質(zhì)組。

根據(jù)先前公布的方法初步合成了3個(gè)具有不同表面化學(xué)成分的NPs（SP-003，SP-007和SP-011）（圖2）。 ，利用掃描電子顯微鏡(SEM)，動(dòng)態(tài)光散射(DLS)，透射電子顯微鏡(TEM)，高分辨率TEM(HRTEM)和x射線光電子能譜(XPS)等技術(shù)對三種NPs的尺寸、形態(tài)和表面特性方面進(jìn)行表征描述（圖2）。 ，DLS測量結(jié)果與掃描電鏡吻合，三種SPIONs為球形和半球形，平均尺寸均在200-300nm范圍內(nèi)；ζ電位（ζ）分析表面電荷量，顯示pH值為7.4時(shí)，ζ值分別為-36.9，+25.8和-0.4mV，代表負(fù)、正和中性表面（圖2）；使用HRTEM評估涂層厚度，

對于SP-003，在氧化鐵芯周圍形成了厚度>10nm的非晶態(tài)殼層（圖2d），對于SP-007和SP-011，形成了相對較薄（<10nm）的非晶形態(tài)外殼（2i，n）；此外，通過XPS進(jìn)行表面分析，證實(shí)了NPs成功包裹了各自的官能團(tuán)。結(jié)構(gòu)表征證實(shí)了三種SPIONs構(gòu)成了一個(gè)多樣化的NPs測試集，之后對蛋白質(zhì)的檢測覆蓋率、精度和響應(yīng)線性度進(jìn)行進(jìn)一步評估。
 

圖2. 三種SPIONs的結(jié)構(gòu)表征

2.蛋白質(zhì)組學(xué)分析三種NPs的初始效果
使用DDA LC-MS/MS分析3種NPs panel，單個(gè)納米顆粒檢出蛋白數(shù)＞500，共檢出蛋白數(shù)＞700（圖3a）。SP-003，SP-007和SP-011三種NPs的中位CVs分別為19.6％、30.3％和17.0％（圖3b）。

為了探索NPs在大范圍濃度范圍內(nèi)檢測血漿蛋白的能力， ，作者將上述三種NPs測量的蛋白質(zhì)特征強(qiáng)度與已發(fā)表的數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較（圖3c），斜率的減小表明蛋白質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)范圍隨豐度的變化而減小，即NPs可以通過親和力結(jié)合有效地歸一化蛋白質(zhì)豐度，從而有效地降低蛋白冠中豐度的動(dòng)態(tài)范圍，有利于低豐度蛋白的檢出。

為了確定平臺(tái)在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證研究中的實(shí)際響應(yīng)度，作者通過添加其他2種蛋白血管生成素和鈣衛(wèi)蛋白（S100a8/9），包括3個(gè)附加的多肽和3個(gè)附加的NPs，對響應(yīng)線性度進(jìn)行了更深入的探索。 ，通過線性回歸對NPs檢測到的數(shù)據(jù)與ELISA結(jié)果進(jìn)行了建模，證實(shí)了線性響應(yīng)，并表明了NP平臺(tái)能夠高精度地測量寬動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)肽段/蛋白質(zhì)水平的相對變化。

之后為了探究背景干擾對蛋白冠組成的影響，文章對不同脂質(zhì)水平和溶血程度下形成的蛋白冠進(jìn)行了檢測。檢測結(jié)果顯示脂質(zhì)水平的高低不會(huì)影響蛋白質(zhì)檢出數(shù)量、組成或強(qiáng)度分布。此外還觀察到不同條件下蛋白質(zhì)數(shù)量的穩(wěn)健性，正常血漿中檢測到的重疊蛋白不受溶血引起的巨大背景變化的影響。
 

圖3. 三個(gè)原始NPs的蛋白質(zhì)組學(xué)表征

3.十種NPs的優(yōu)化組合
文章基于3種NPs的組合對蛋白質(zhì)的檢測覆蓋率、精度和響應(yīng)線性度進(jìn)行了評估，之后為進(jìn)一步拓展蛋白冠的檢測深度，對43個(gè)候選SPIONs進(jìn)行篩選，最終產(chǎn)生一個(gè)由10個(gè)NPs組成的優(yōu)化panel，CVs分布范圍為16.4％至30.8％（圖4b）。將定量結(jié)果與已發(fā)布的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較，檢測精度與檢測深度均要高于已發(fā)布的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集。 ，與血漿蛋白數(shù)據(jù)庫的比較結(jié)果顯示，10NPs-panel的蛋白組成幾乎覆蓋了數(shù)據(jù)庫的整個(gè)動(dòng)態(tài)范圍。在目前已知的蛋白標(biāo)志物研究中，多集中分布在高豐度范圍內(nèi)，新型蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物的出現(xiàn)率非常低（每年少于2種），10NPs-panel在90個(gè)生物標(biāo)記物中，能夠在每個(gè)NPs和純血漿中鑒定出33至43個(gè)FDA標(biāo)志物（圖4c），蛋白冠™蛋白質(zhì)組學(xué)對于低豐度生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)具有重要意義。

為了確定參考血漿蛋白質(zhì)組中存在的功能類別，由Uniport ID向注釋數(shù)據(jù)庫(GOCC, GOBP, KEGG, Uniprot Keywords, Pfam)進(jìn)行映射，并比較了10個(gè)NPs panel的富集結(jié)果。結(jié)果顯示出在分泌、先天免疫和囊泡等多種功能注釋上的顯著富集（圖4d），以及不同NPs之間在功能富集上的差異性（圖4e）。總的結(jié)果表明，NP冠狀物不僅可以根據(jù)單個(gè)蛋白質(zhì)的水平進(jìn)行分類，還可以根據(jù)蛋白質(zhì)的功能基團(tuán)進(jìn)行分類。此外，NP富集不同功能類別蛋白質(zhì)（即細(xì)胞外，細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)）的能力說明了NP冠狀物在復(fù)雜蛋白質(zhì)組中采樣的寬動(dòng)態(tài)范圍。
 

圖4. 與純血漿相比，優(yōu)化了10個(gè)NPs孔板

4.大規(guī)模應(yīng)用：非小細(xì)胞肺癌研究
為了說明蛋白冠技術(shù)在大隊(duì)列研究中的應(yīng)用，文章對NSCLC（非小細(xì)胞肺癌）受試者以及與年齡和性別相匹配的健康肺部合并癥對照受試者進(jìn)行了快速而深入的血漿蛋白質(zhì)組分析（圖5）。從最初的10個(gè)NPs中選擇5個(gè)組成panel，以最大限度地優(yōu)化蛋白質(zhì)組覆蓋率，進(jìn)一步減少總的實(shí)驗(yàn)時(shí)間。在整個(gè)研究過程中使用QC樣品評估精度。結(jié)果表明Proteograph可以在短時(shí)間內(nèi)快速評估大量樣本，同時(shí)進(jìn)一步提升精度和廣度。

為了研究早期NSCLC檢測的可能性，對80名健康受試者和61名早期NSCLC受試者組成的樣本集進(jìn)行了分類建模，141位受試者在5種NPs中平均檢測到1664種蛋白質(zhì)（圖5a），依靠無監(jiān)督的聚類分析，由NPs檢測結(jié)果表現(xiàn)出不同的蛋白質(zhì)豐度模式簇（圖5b）。

作者進(jìn)一步將研究重點(diǎn)放在NPs中檢測到的而去高豐度蛋白血漿未檢測到的蛋白上，對它們發(fā)揮的作用展開了深入研究，使用隨機(jī)森林模型，量化了健康人群與早期NSCLC患者的分類表現(xiàn)，分析數(shù)據(jù)平均AUC為0.91（圖5c），受試者的隨機(jī)分類排列平均AUC僅達(dá)到0.51，這證實(shí)了分類器結(jié)果中不存在過度擬合的情況。檢查前20個(gè)分類器特征(NP和蛋白質(zhì)組的組合)，按特征重要性排序，通過Open Targets(OT)注釋判斷，突出顯示已知和未知的蛋白質(zhì)在NSCLC中發(fā)揮作用（圖5d）。在最重要的特征中，鑒定到了微管蛋白，它是化療藥物(包括紫杉醇及其衍生物)的靶點(diǎn)。此項(xiàng)研究為臨床隊(duì)列中使用多個(gè)NPs識(shí)別蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物提供了參考依據(jù)。
 

圖5. 使用五個(gè)NPs對早期NSCLC與健康受試者進(jìn)行分類

結(jié)論
本文介紹了高通量和自動(dòng)化的蛋白質(zhì)分離技術(shù)平臺(tái)(Proteograph)，該平臺(tái)從46種具有不同理化性質(zhì)的NPs中篩選得到一組NPs整合到體外測定中，用于蛋白冠形成和LC-MS/MS分析，以實(shí)現(xiàn)無偏蛋白的收集/檢測。使用混樣（pool）血漿作為模型復(fù)雜的生物樣品，驗(yàn)證了以下假設(shè)：較大的NP panel可識(shí)別更多的蛋白質(zhì)，尤其是低豐度蛋白質(zhì)。

在一組10個(gè)NPs的panel中發(fā)現(xiàn)了不同的蛋白質(zhì)和與各自蛋白冠相關(guān)的蛋白質(zhì)途徑，表明添加更多不同的NPs可以實(shí)現(xiàn)更廣泛和更深入的蛋白質(zhì)組分析，因此類似于基因測序中不同的覆蓋水平，可以通過改變NPs的數(shù)量和類型來定制平臺(tái)，以在不同的水平上對蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析。此前研究中使用相同的NP panel檢測到53種FDA批準(zhǔn)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，但這些生物標(biāo)記大多在高豐度范圍內(nèi)被檢測到，鑒于NPs可以檢測到大量的低豐度蛋白，預(yù)測未來的研究將使用組合NPs來鑒定許多新穎的生物標(biāo)記。