代謝組學助力研究黨參遠志散對記憶障礙大鼠學習能力和腸道菌群的影響

文章標題：Effects of Dangshen Yuanzhi Powder on learning ability and gut microflora in rats with memory disorde
發(fā)表期刊：Journal of Ethnopharmacology
影響因子：5.195
作者單位：山西中醫(yī)藥大學
百趣提供服務：糞便16S rRNA菌群測序分析

研究背景
記憶障礙(Memory disorder, MD)是一種常見的臨床癥狀，主要指由病理生理或情境原因產(chǎn)生的永久性或暫時性信息識別能力喪失。目前，開發(fā)能夠幫助改善記憶或認知的新藥是醫(yī)學和社會的共同需要。在臨床實踐中，一些單靶點化療藥物難以適應不同類型的MD，且許多治療藥物往往存在藥物依賴、戒斷反彈高、副作用嚴重等缺陷。

中醫(yī)作為一種補充和替代醫(yī)學，對MD具有較好的預防和治療效果，具有綜合和綜合治療優(yōu)勢。遠志散是一種常用的中藥復方，具有增強記憶和學習的功效。早期研究表明黨參遠志散(Dangshen Yuanzhi Powder, DYP)可提高MD動物的學習記憶能力，且其療效優(yōu)于或相當于使用人參(Ginseng Radix Et Rhizoma, GRR)遠志散。

為揭示腸道菌群在DYP治療MD中的作用，按每組12只大鼠，分為對照組(control)、MD組(Model)、吡拉西坦組(Piracetam)、DYP低劑量處理組(DYP low dose treatment group, DYP-L)和DYP高劑量處理組(DYP high dose treatment group, DYP-H)。除對照組外，其余各組大鼠均腹腔注射400mg/kg的D-半乳糖(D-Galactose, D-Gal)，并灌喂氯化鋁(200mg/kg)，連續(xù)50天。

從第15天開始，DYP組大鼠灌胃不同劑量的DYP（低劑量：6.67g/kg，高劑量：13.34g/kg），吡拉西坦組給藥吡拉西坦片混懸液0.5g/kg，模型組及對照組在實驗期間用相同體積的生理鹽水處理。代謝組學分享，通過“菌-腸-腦”軸探討DYP的調(diào)控機制，探索DYP治療MD的相關(guān)腸道菌群調(diào)節(jié)途徑，對大鼠腸道菌群進行16S rRNA高通量測序，以評估DYP對腸道菌群的影響。此外，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對腸道菌群的功能進行預測，分析DYP對MD的潛在作用機制，為進一步闡明DYP的作用機制提供了更多的理論依據(jù)。

研究結(jié)果
01血清中DYP成分的鑒定與分析
對黨參遠志散入血成分進行了鑒定。經(jīng)標準品鑒定為3,6'-二芥子�；�蔗糖、β-細辛醚、小檗堿、巴馬汀和苦參堿。

02DYP對大鼠體重的影響
在實驗過程中，各組大鼠的體重都有不同程度的增加趨勢。代謝組學分享，DYP組大鼠體重變化趨勢相同，實驗前期體重保持穩(wěn)定，無明顯變化，后期體重上升趨勢與對照組相同。吡拉西坦組大鼠體重在實驗前半段呈下降趨勢，后半段與對照組一樣呈上升趨勢。
 

圖1. DYP對MD大鼠體重的影響

03大鼠趨向?qū)嶒灲Y(jié)果
訓練后各組大鼠的逃避潛伏期逐漸降低（圖2A），DYP能顯著增加大鼠在平臺內(nèi)的停留時間、進入平臺的次數(shù)和在平臺內(nèi)的運動距離（圖2B-D），DYP–H組的藥效學效果更為顯著，上述三個指標的增長率分別為27%、58%和60%。圖2E顯示，D-Gal和三氯化鋁誘導MD后，MD大鼠在探索平臺時表現(xiàn)出明顯的邊緣搜索策略，搜索能力較差，認知障礙明顯。
 

圖2. Morris Water Maze Test評價指標

04DYP對血清中相關(guān)酶表達的影響
與對照組相比，MD大鼠血清中單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、神經(jīng)絲輕鏈蛋白(neurofilament light chain protein, NF-L)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)表達明顯增加，表明存在MD（圖3A-C）。代謝組學分享，圖D表明，與對照組相比，MD大鼠血清中腫瘤壞死因子-α（the tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表達顯著降低。DYP- H組可顯著提高MD大鼠的TNF-α水平，且療效優(yōu)于DYP- L組和吡拉西坦組，表明DYP可通過調(diào)節(jié)血清中MCP-1、NF-L、NSE、TNF-α的表達來改善記憶障礙大鼠的學習記憶能力。
 

圖3. DYP對MD大鼠血清中MCP-1、NF-L、NSE、TNF-α表達量的影響

05十二指腸和結(jié)腸組織的病理學分析
各組大鼠十二指腸和結(jié)腸組織的組織病理學檢查結(jié)果顯示，對照組未見明顯病理變化。代謝組學分享，與對照組相比，MD大鼠十二指腸和結(jié)腸黏膜損傷，出現(xiàn)絨毛短寬、隱窩加深、結(jié)構(gòu)不完整斷裂、脫落等病理改變。與模型組比較，各組大鼠給藥后均表現(xiàn)出不同程度的恢復，十二指腸和結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)相對完整，絨毛長度增加，隱窩變淺。不同劑量DYP對大鼠十二指腸和結(jié)腸黏膜病理損傷均有修復作用（圖4）。
 

圖4. MD大鼠腸道組織的病理學形態(tài)改變（HE，×400）。（A）十二指腸病理圖片（a-e分別為control、model、Piracetam、DYP-L組和DYP-H組）；（B）結(jié)腸上皮的病理圖片（a-e分別代表control、model、Piracetam、DYP-L組和DYP-H組）

06腸道菌群α-多樣性和β-多樣性分析
根據(jù)腸道菌群α-多樣性分析可知，各組大鼠在誘發(fā)MD后腸道菌群多樣性和豐度均升高，且吡拉西坦組持續(xù)升高。代謝組學分享，同時，發(fā)現(xiàn)DYP對MD大鼠腸道菌群豐度具有雙向調(diào)節(jié)作用。DYP-L增加了大鼠腸道菌群的豐度，而DYP-H使腸道菌群豐度降低至正常水平。β-Diversity分析反映了不同組間樣品菌群結(jié)構(gòu)的顯著差異。

07腸道菌群組成分析
如圖5A所示，在門水平上，厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋體門和變形菌門為優(yōu)勢菌。MD大鼠腸道菌群組成與對照組差異較大，厚壁菌門增多，擬桿菌門減少。DYP-H能顯著降低厚壁菌門水平，顯著或極顯著增加擬桿菌門水平。如圖B所示，在屬水平上，乳酸菌和普雷沃氏菌為優(yōu)勢菌屬。代謝組學分享，與對照組相比，模型組乳酸菌比例顯著升高，普雷沃氏菌比例顯著降低。

吡拉西坦和DYP-L組中，乳酸菌比例顯著降低，普雷沃氏菌比例保持不變。DYP-H對降低乳酸菌和增加普雷沃氏菌有較好的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，DYP可通過調(diào)節(jié)腸道菌群組成，在一定程度上恢復MD大鼠腸道菌群失調(diào)狀態(tài)。
 

圖5. 相對豐度最高的10個細菌群落。(A)門水平；(B)屬水平

08微生物種類的線性判別分析
如圖6所示，厚壁菌門是DYP-H組的標志菌群，這顯著影響了DYP-H組與其他組的差異，表明DYP-H能改善MD大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加厚壁菌門含量。
 

圖6. 標記區(qū)系的LEfSe分析。(A)不同物種的進化分支；(B)不同物種的LDA分布

09腸道菌群組成和血清生化指標的相關(guān)性分析
選取前10個高豐度菌屬和4個血清生化因子MCP-1、NF-L、NSE和TNF-α進行Pearson相關(guān)分析。代謝組學分享，如圖11所示，MCP-1與乳桿菌呈高度正相關(guān)趨勢，與蘇黎世桿菌及Prevotellaceae_Ga6A1_group呈高度負相關(guān)趨勢。NF-L的表達與普雷沃氏菌呈高度負相關(guān)趨勢，而TNF-α的表達與普雷沃氏菌呈高度正相關(guān)趨勢。

由此表明乳酸菌、蘇黎世桿菌、普雷沃氏菌和Prevotellaceae_Ga6A1_group與MD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。DYP可能通過調(diào)節(jié)這些細菌屬發(fā)揮改善記憶的作用，具體機制有待進一步研究。
 

圖7. 大鼠血清生化因子表達與腸道菌群屬水平的相關(guān)性分析

10腸道菌群功能分析
根據(jù)16s rRNA測序數(shù)據(jù)進行KEGG功能注釋，得到KEGG各功能水平OTUs的注釋信息以及不同樣本中各功能的豐度信息（圖8）。為了進行綜合比較，在Level 2選擇了基因相對豐度較高的前5個功能，在Level 3統(tǒng)計了它們的功能注釋信息，篩選出了幾個相對豐度較高的功能。代謝組學分享，結(jié)果表明，在Level 3（圖9），腸道菌群主要影響氨基�；�-tRNA生物合成、核糖體、糖酵解/糖異生、線粒體生物生成和丙酮酸代謝的功能。
 

圖8. Level 2腸道菌群KEGG分析
 

圖9. Level 3腸道菌群KEGG分析

結(jié)論
采用Morris水迷宮和16S rRNA菌群測序等技術(shù)對MD動物模型進行研究，探討DYP的調(diào)節(jié)機制。D-Gal和三氯化鋁誘導后，MD大鼠的學習和空間記憶能力明顯下降，并伴有體重增加和腸道菌群紊亂。

DYP可通過恢復腸道菌群紊亂和恢復與認知密切相關(guān)的異常血清生化指標，改善MD大鼠的學習和空間記憶能力。這提示DYP的存在可通過“菌-腸-腦”軸提高MD大鼠的學習記憶能力。但DYP的具體調(diào)控機制還有待進一步研究。