中藥入血/入靶成分代謝產物的表征分析助力發(fā)好文章

 

前言

 

2021年03月，北京中醫(yī)藥大學藥學院高教授課題組在Journal of Pharmaceutical Analysis發(fā)表的題為 “Corydalis Rhizoma as a model for herb-derived trace metabolites exploration: A cross-mapping strategy involving multiple doses and samples”（IF：14.026）的研究成果。研究以延胡索為模型，采用：分析高劑量草藥提取物的代謝物，表征同一生物樣品中臨床劑量草藥提取物的代謝物；基于不同生物樣品中代謝物具有不同離子豐度的事實，應用不同生物樣品的交叉圖譜來鑒定微量代謝物兩種方法。與不使用該策略相比，多檢出44種臨床劑量的草藥提取物代謝物。這項研究提高了目前草藥衍生代謝物表征方法的深度、廣度和準確性。

 

 

基本信息

 

延胡索作為草藥衍生微量代謝產物探索的模型：一種涉及多劑量和樣本的交叉映射策略

研究對象：延胡索

發(fā)表期刊：Journal of Pharmaceutical Analysis

影響因子：14.026

發(fā)表時間：2021年03月

合作單位：北京中醫(yī)藥大學藥學院、華西醫(yī)院消化內科

運用生物技術：UPLC-Q-TOF/MS液質聯(lián)用

 

研究背景

 

體內吸收的藥物成分及相關代謝物是疾病治療的有效物質基礎。因此，解讀中草藥中多種成分的代謝物對揭示藥效學成分具有重要意義。但中草藥的化學成分多為低含量的次生代謝物，其體內代謝物含量接近微量，難以實現(xiàn)全面的檢測和鑒定。延胡索（罌粟科）（中國延胡索）的干根莖，具有促進血液循環(huán)、促氣、止痛等作用。對延胡索生物堿的綜合代謝譜的研究較少，加上分析方法的固有局限，代謝物尚未完全發(fā)現(xiàn)，延胡索的藥效學成分也尚不清楚。目前迫切需要一種有效的代謝物檢測和鑒定方法。

 

研究思路

 

圖1.  延胡索生物堿代謝物鑒定所提出的分析策略匯總圖

 

研究方法

 

1.實驗材料：

植物：延胡索；化學試劑：LC/MS級的水，甲酸、乙腈、甲醇；原阿片堿、延胡索乙素、四氫小檗堿、棕櫚堿標準品。動物：雄性SD大鼠（200±10）。

 

2. 樣本數(shù)量及分組：

2.1大鼠分組：38只大鼠分三組，糞便和尿組（12）、血漿組（¼12）和膽汁組（14）。糞便組和尿液組大鼠分為6組，分別口服4個參考標準品（2.00 mL，20mg/kg）、臨床劑量（0.56 mL）和大劑量（1.20 mL），分別采集12只大鼠給藥前后24 h的糞便和尿樣。血漿組：分組給藥方式同上，收集13個時間點血漿樣本。膽汁組：分組及給藥同，另多有2只大鼠為空白對照。10%水合氯醛麻醉進行膽管插管，收集膽汁0-12h和12-24h樣本。存于-80℃。

 

2.2延胡索樣品準備：研磨成粉過40目篩，將約20 g粉末在200 mL蒸餾水中浸泡1h，煎煮2次，每次30 min。合并提取液，最終溶解成40mL，相當于0.5g中藥（藥典中延胡索的臨床口服劑量為3-10g/人，因此，延胡索的臨床劑量為1.4 g/kg，即0.28g/大鼠（0.56 mL）。大劑量為3 g/kg，即0.6g/大鼠（1.2 mL)。

 

2.3血液、尿液和膽汁樣本的制備：樣品解凍后，各時間點混合200 uL血漿。將適量的混合樣品（血漿100 uL，尿液1 mL，膽汁150 uL）與三倍量的甲醇混合。渦旋30s后在4℃，12000rpm離心10min去除蛋白。上清液氮氣干燥，70%甲醇復溶并離心15min，取上清液用于UPLC-Q-TOF/MS分析。

 

2.4糞便樣品制備：200 mg糞便在4 mL甲醇中渦旋30 s，放置1h。然后在4℃，12000rpm離心15 min，上清液用氮氣干燥。甲醇復溶，離心15 min。上清液用于UPLC-Q-TOF/MS分析。

 

3. 采用的技術：Waters UPLC Class液相系統(tǒng)聯(lián)用Waters SYNAPT G2-SI MS質譜系統(tǒng)。采用MassLynx V4.1軟件控制儀器并采集數(shù)據(jù)，UNIFI軟件進行數(shù)據(jù)處理。其實驗流程設計見圖1。

 

研究結果

 

1.母體化合物的碎裂模式

母體藥物和相關代謝物通常具有相同的骨架，其碎裂模式相似。為了更好地利用LC-MS技術對代謝物進行分析，有必要充分了解母體化合物的碎裂方式。延胡索生物堿主要分為四氫小檗堿、原小檗堿、原阿片堿和阿樸啡四種類型。

圖S1. 四氫小檗堿的MS/MS譜及其特征性裂解途徑    

圖S2. 延胡索乙素的MS/MS譜及其特征性裂解途徑

 

如圖S1和S2示，四氫小檗堿和延胡索乙素均有飽和C環(huán)，易發(fā)生RDA裂解，原阿片堿結構與四氫小檗堿相似，也易發(fā)生RDA裂解（圖S3）。RDA裂解后通過進一步脫水形成最豐富的片段離子。而棕櫚堿C環(huán)不飽和，極難形成RDA裂解（圖S4）。酰胺基中存在弱鍵，因此阿樸啡型生物堿很容易失去（CH3）2NH或CH3NH2取代基，產生最豐富的[M-45.0578]⁺或[M-31.0344]⁺片段作為特征離子（圖S5）。

圖S3. 原阿片堿的MS/MS譜及其特征性裂解途徑

圖S4. 棕櫚堿的MS/MS譜及其特征性裂解途徑

 

圖S5. 海罌粟堿的MS/MS譜及其特征性裂解途徑

 

2.代表性化合物的代謝研究

選擇四氫小檗堿、延胡索乙素、原阿片堿和棕櫚堿并根據(jù)文獻總結的母體代謝途徑鑒定這些成分的代謝途徑（圖2）。四種具有代表性化合物的所有代謝物均列于表S1-S4（補充材料）�；�于MS信息和標準品中總結的代謝途徑，提出了MCFs來表征延胡索提取物的代謝產物（表1）。

圖2. (A)四氫小檗堿、(B)延胡索乙素、(C)原阿片堿和(D)棕櫚堿的代謝途徑

 

表1. 延胡索衍生代謝物的代謝特征片段（MCFs）

 

3.建立化學結構篩選表

值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)延胡索生物堿的骨架在代謝過程中沒有變化。因此，根據(jù)替代品的類型和數(shù)量以及體內代謝途徑總結了化學結構篩選表（表2-4），為結構鑒定提供參考。

表4. 原小檗堿化學結構篩選表（篇幅原因，此處只放表4，表2-3模式同此表）

紅色數(shù)字表示與延胡索代謝產物匹配的準分子離子

 

4.延胡索衍生化合物的綜合鑒定

4.1初篩中檢測到的代謝物的鑒定：以臨床劑量延胡索提取物血漿樣品中的代謝產物MN-100為例說明了鑒定過程（圖3）。在正離子模式下，準分子離子為m/z504.1881[M+H]⁺，化學式為C25H29NO10。碎片離子m/z328.1548[M+H]⁺是葡萄糖醛酸化的代謝物，并在表2中檢索到分子離子及7種對應的代謝物結構。表明MN-100與四氫小檗堿具有相同的骨架，在C2-C3位置有兩個羥基取代，在C13位置有一個甲基取代，在C9-C10位置有一個葡萄糖醛酸和一個甲氧基。MN-100的質譜圖及結構圖如圖4所示。

圖3. 臨床延胡索提取液給藥血漿樣品的色譜圖。(A)m/z 504.1881的提取物離子色譜圖，(B)血漿樣品的總離子色譜圖

表2. 四氫小檗堿化學結構篩選表

 

圖4. MN-100的質譜和結構

 

4.2以高劑量延胡索提取物的代謝物為偽標準來鑒別臨床劑量的方法：圖5A中的代謝物MN-106由于豐度低、峰形差，在初篩中未檢測到。然而，在相同的保留時間，高劑量血漿樣品中的代謝產物MH-119被鑒定為甲基化和葡萄糖醛酸化的延胡索乙素。臨床劑量和高劑量提取物的血漿樣本中m/z 518.2028的EICs如圖5A所示。在MS/MS譜（圖5B）中，臨床劑量提取物樣品中的碎片離子響應值較低，幾乎淹沒在基線中，但具有與高劑量樣品中相同的碎片模式，說明臨床劑量提取物樣品中也存在MH-119。

圖5. 在臨床劑量和高劑量提取物的血漿樣品中，m/z 518.2028的提取物離子色譜(A)和MS/MS光譜(B)

 

4.3通過對不同生物樣本的交叉定位，鑒定不同樣品中的微量代謝物:同一生物樣品在不同劑量下獲得的代謝物幾乎完全一致，因此該方法有助于對同一樣品中的代謝物的鑒定。通過保留時間和m/z值，將一個樣品中豐度較強的代謝物相應地映射到其他三個樣品中，從而可以識別出不同樣品中的微量代謝物。以臨床劑量延胡索血漿樣本中的代謝物MN-28和MN-29為例，說明該策略。如圖6A和B所示，在不同劑量的血漿樣品中，這兩個峰的MS響應很弱。

圖6. m/z 342.1715的提取物離子色譜圖： (A)臨床劑量血漿樣本、(B)高劑量血漿樣本和(C)臨床劑量尿液樣本

 

從高劑量到臨床劑量的方法不能從血漿樣本中識別，在尿液樣本中檢測到6種準分子離子342.1715[M+H]⁺的代謝物。在尿樣的初篩結果中，保留時間分別為9.05 min和9.83 min的峰被鑒定為氫化四氫小檗堿。在m/z178.0859[M+H-C10H12O2]⁺處的片段離子反應表明其結構與四氫小檗堿相似，在表2中搜索了理論準分子離子m/z 342.1705，四氫小檗堿骨架的C-2、C-3、C-9和C-10處可能有3個甲氧基和1個羥基，表明氫化反應發(fā)生在A環(huán)，其結構及質譜如圖7示。如圖6A和B所示，從血漿樣品中提取m/z 342.1715的離子，與在尿液中相同的保留時間內獲得四個具有相同m/z值的色譜峰（圖6C）。

圖7. MN-28和MN-29的質譜和結構

 

4.4延胡索生物堿的結構與代謝的關系：延胡索生物堿的結構與代謝密切相關。去甲基化是最常見和頻率最高的代謝反應。從圖8可以看出，棕櫚堿在甲氧基取代時最容易發(fā)生去甲基化，其次是延胡索乙素、四氫小檗堿和原阿片堿，甲基化反應則相反。其余的羥基容易發(fā)生硫酸鹽化和葡萄糖醛酸化。葡萄糖醛酸化和硫酸化反應只發(fā)生過一次，而不是同時發(fā)生。只有兩種代謝物被檢測到被硫酸化兩次。

圖8.四個參考標準中代謝物類型的相對百分比

 

含亞甲基二氧基的組分會失去一個CO分子，而不含取代基的組分不會發(fā)生裂解，如延胡索乙素和棕櫚堿的情況所示。原阿片堿類生物堿的五元含氧環(huán)和碳基易于氫化。前者變成一個甲氧基和一個羥基，后者變成一個羥基。羥基不穩(wěn)定，容易發(fā)生脫羥基化。二羥基化在其他結構類型中沒有發(fā)生。原小檗堿型生物堿由于不飽和C環(huán)而沒有發(fā)生RDA裂解。因此，其結構難以確定，在代謝過程中非常穩(wěn)定。棕櫚堿只發(fā)生去甲基化和羥基化反應，代謝產物主要分布在糞便中，而不是分布在膽汁中，提示它可能是由腸道而不是肝臟代謝的。

 

中藥的體內代謝過程非常復雜，代謝物的結構多樣化，這使其作用機制難以解釋。因此，明確代謝物的結構對于證明藥物的作用機制具有重要意義。比體外化學成分更豐富的結構代謝產物類型，將有助于尋找延胡索的生物活性成分。

 

研究結論

 

 

1.研究采用不同樣品和劑量的交叉組合，從臨床標準和從高標準到臨床劑量的策略中檢測到127種代謝物。

2.將化學結構篩選表與特征片段離子相結合，闡明了代謝物的結構。

3.繪制了四種具有代表性標準的大鼠更準確的代謝途徑，并證實了延胡夫生物堿的結構與代謝之間的關系。

 

文章推薦

 

1.該策略在草藥衍生代謝產物研究中具有優(yōu)勢。解決了生物樣品基質響應高、代謝物濃度低、峰形不明顯、MS/MS信息缺失等問題。

2.本研究提出的策略將是發(fā)現(xiàn)藥效學物質和代謝機制研究的有力工具。

 

參考文獻

[1] G.F. Feng, Y.F. Sun, S. Liu, et al., Stepwise targeted matching strategy from in vitro to in vivo based on ultraehigh performance liquid chromatography tandem mass spectrometry technology to quickly identify and screen pharmacodynamic constituents, Talanta 194 (2019) 619e626.

[2] S.T. Yu, H.X. Liu, K. Li, et al., Rapid characterization of the absorbed constituents in rat serum after oral administration and action mechanism of Naozhenning granule using LC-MS and network pharmacology, J. Pharmaceut. Biomed. Anal. 166 (2019) 281e290.

[3] H.Y. Zhang, S.R. Duan, L. Wang, et al., Identifification of the absorbed components and their metabolites of Tianma-Gouteng granule in rat plasma and bile using ultra-high-performance liquid chromatography combined with quad rupole time-of-flflight mass spectrometry, Biomed. Chromatogr. 33 (2019), e4480.