精原干細(xì)胞移植后出生小鼠子代中的精子DNA甲基化變化機(jī)制

精原干細(xì)胞移植（Spermatogonial stem cell transplantation，SSCT）被提議作為兒童癌癥幸存者的生育療法。SSCT首先冷凍保存睪丸活檢，然后再進(jìn)行性腺毒性治療（如癌癥治療）。當(dāng)兒童癌癥幸存者成年并想要親生孩子時(shí)，可以將活檢組織解凍并在體外增殖精原干細(xì)胞（SSC），隨后將其自動(dòng)移植回睪丸。然而，長期增殖過程中的培養(yǎng)應(yīng)激可能會(huì)導(dǎo)致SSC的表觀遺傳學(xué)變化，如DNA甲基化變化，并可能遺傳給SSCT后出生的子代。因此，在臨床實(shí)施這種新型細(xì)胞療法之前，SSCT需要對衍生子代進(jìn)行詳細(xì)的臨床前表觀遺傳學(xué)評估。
 
2023年04月07日，荷蘭阿姆斯特丹大學(xué)UMC生殖醫(yī)學(xué)中心生殖生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室Callista L Mulder團(tuán)隊(duì)在《Clin Epigenetics》雜志發(fā)表了題為“Sperm DNA methylation is predominantly stable in mice offspring born after transplantation of long-term cultured spermatogonial stem cells”的研究論文，該研究通過使用簡化甲基化測序（RRBS）在多代小鼠模型中研究了SSCT衍生子代具有體外增殖SSC精子的DNA甲基化狀態(tài)。
標(biāo)題：Sperm DNA methylation is predominantly stable in mice offspring born after transplantation of long-term cultured spermatogonial stem cells在長期培養(yǎng)的精原干細(xì)胞移植后出生的小鼠后代中，精子DNA甲基化水平穩(wěn)定
時(shí)間：2023.04.07
期刊：Clinical Epigenetics
影響因子：IF 7.259
技術(shù)平臺：RRBS、BSP、RT-qPCR等
樣本實(shí)驗(yàn)：

研究設(shè)計(jì)：SSCT子代的多代小鼠模型

F0：移植小鼠，F(xiàn)1：SSCT后出生的第一代，F(xiàn)2：SSCT后親本出生的第二代，F(xiàn)2/M：F2由母系產(chǎn)生，F(xiàn)2/P：F2由父系產(chǎn)生。從代際子代的5只雄性小鼠采集附睪精子，比較DNA甲基化狀態(tài)（F0的n=3，F(xiàn)1和F2的每個(gè)子代亞組n=5）

研究結(jié)果：
通過對第一代和第二代SSCT出生小鼠子代的精子進(jìn)行RRBS DNA甲基化測序分析，以此來評估SSCT衍生子代的分子表觀遺傳穩(wěn)定性，并將其與對照組精子進(jìn)行比較分析。研究結(jié)果表明，在所有子代中，DNA甲基化差異比例占總CpG和甲基化區(qū)域不到0.5%。所有樣品的無監(jiān)督聚類分析沒有顯示出基于甲基化差異模式的明顯分組。對與對照組相比在多代SSCT子代中顯著變化的少數(shù)單個(gè)基因用定量亞硫酸鹽Sanger測序（BSP）和RT-qPCR在不同器官中進(jìn)行了驗(yàn)證。僅Tal2的差異甲基化得到證實(shí)，與對照F1相比，Tal2在SSCT子代的精子中低甲基化，且在SSCT F1子代的卵巢中表現(xiàn)出更高的基因表達(dá)。表明在F1代和F2代精子中，SSCT衍生的子代和對照組之間的DNA甲基化沒有顯著差異。
 
研究圖表：
圖1：所有樣品平均甲基化的無監(jiān)督聚類熱圖。
所有樣本的熱圖聚類基于每個(gè)樣本之間的顯著差異甲基化（F0 n=3在，F(xiàn)1和F2 子代亞組n=5）和所有樣品的平均甲基化（duplo），熱圖中包括前500個(gè)變化最大的DMR（高甲基化和低甲基化）的中淺灰色的最后2行

表1：對照組F0/對照組F1與SSCT組/SSCT亞組之間顯著差異的所有DMC和DMR

圖2：與對照組F1相比，SSCT F1和SSCT F2的CpG位點(diǎn)的差異分析（DMC）。

1. 火山圖顯示了SSCT樣品和對照樣品之間CpG甲基化模式變化的CpG數(shù)量，顯著高于或低于25%差異截止值并考慮了q值閾值為0.01。x軸和y軸上的值分別是校正后p值的甲基化差異百分比和-log10。
2. 代際間的差異甲基化CpG（DMC）在DNA區(qū)域外顯子、內(nèi)含子、啟動(dòng)子和基因間區(qū)域的分布。

 圖3：與對照F1相比，SSCT F1和SSCT F2子代的DMR差異分析。

1. 火山圖顯示了SSCT樣品和對照樣品之間甲基化模式改變的DMR數(shù)量。
2. DNA區(qū)域外顯子、內(nèi)含子、啟動(dòng)子和基因間區(qū)域的差異甲基化區(qū)域（DMR）分布。

表2：在SSCT F0、SSCT F1和SSCT F2代際之間的外顯子和啟動(dòng)子區(qū)域中共有的DMR變化基因（粗體字體），這些基因?qū)⑦M(jìn)一步驗(yàn)證


圖4：對單個(gè)精子樣本的Tal2基因的RRBS結(jié)果進(jìn)行BSP驗(yàn)證。整體CpG平均值如下：對照F1 24.7%±4.4%、SSCT F1 17.4%±4.5%、SSCT F2/M 22.7%±9.3%、SSCT F2/P 14.5%±3.2%表現(xiàn)出SSCT和對照之間甲基化差異最大（10%）。


圖5：RT-qPCR比較Tal2基因表達(dá)分析
F1、F2/M和F2/P中對照組F1和SSCT子代之間的睪丸（A）、卵巢（B）和腎（C）的平均表達(dá)率。條形圖和ANOVA的統(tǒng)計(jì)分析以及Tukey事后檢驗(yàn)代表了代際組之間的RNA表達(dá)，（每個(gè)器官n=5，F(xiàn)1和F2中的每個(gè)子代亞組，在技術(shù)三倍體中進(jìn)行RT-PCR）*兩組間觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（p < 0.05)。


參考文獻(xiàn)：
Serrano JB, Tabeling NC, de Winter-Korver CM, van Daalen SKM, van Pelt AMM, Mulder CL. Sperm DNA methylation is predominantly stable in mice offspring born after transplantation of long-term cultured spermatogonial stem cells. Clin Epigenetics. 2023 Apr 7;15(1):58.