DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組分析揭示野生草莓干旱脅迫分子調(diào)控機(jī)制
干旱脅迫是對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生不利影響的關(guān)鍵環(huán)境因素。為此，植物發(fā)展出各種響應(yīng)機(jī)制（干旱逃逸、避免、耐受和回復(fù)），以通過(guò)進(jìn)化增強(qiáng)抗旱性，這些適應(yīng)機(jī)制從分子到植物水平都所不同。黃毛草莓（Fragaria nilgerrensis）是一種具有良好抗旱性的二倍體野生草莓，可為提高栽培草莓抗旱性提供有用的候選基因。到目前為止，其參與干旱脅迫相關(guān)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清楚。
2022年10月28日，云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院?jiǎn)糖俳淌趫F(tuán)隊(duì)與云南中醫(yī)藥大學(xué)張?bào)w操團(tuán)隊(duì)聯(lián)合在《BMC Plant Biol》雜志發(fā)表題為“Integrated transcriptome and methylome analyses reveal the molecular regulation of drought stress in wild strawberry (Fragaria nilgerrensis)”的研究論文，研究通過(guò)對(duì)黃毛草莓（F. nilgerrensis）干旱脅迫處理過(guò)程中四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)譜、全基因組DNA甲基化圖譜和生理性狀的綜合分析，研究了F. nilgerrensis的干旱響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
標(biāo)題：Integrated transcriptome and methylome analyses reveal the molecular regulation of drought stress in wild strawberry (Fragaria nilgerrensis) 整合轉(zhuǎn)錄組和甲基化組分析揭示了野生草莓干旱脅迫的分子調(diào)控
時(shí)間：2022-10-28
期刊：BMC Plant Biology
影響因子：IF 5.26
技術(shù)平臺(tái)：WGBS、RNA-seq、qRT-PCR分析等
項(xiàng)目設(shè)計(jì)：
采集同一克隆的F. nilgerrensis野生草莓作為實(shí)驗(yàn)材料，在溫室中進(jìn)行干旱處理實(shí)驗(yàn)，分為對(duì)照組和處理組：（i）對(duì)照組：每2天澆水一次；（ii）干旱處理組：植物從0d到12d沒(méi)有澆水。在持續(xù)干旱脅迫處理期間的四個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集F. nilgerrensis葉片：0d（T0，CK），4d（T4），8d（T8）和12d（T12）（圖1A）。在干旱脅迫下的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的上午9點(diǎn)~10點(diǎn)之間對(duì)葉片進(jìn)行取樣，立即在液氮中冷凍，-80℃保存。在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得的葉片用于DNA甲基化分析（WGBS）、轉(zhuǎn)錄組分析(RNA-seq)和qRT-PCR分析的材料，，實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。
結(jié)果圖形
（1）干旱脅迫下F. nilgerrensis的生理性狀
圖1：干旱脅迫實(shí)驗(yàn)材料
（A） F.nilgerrensis對(duì)干旱響應(yīng)的形態(tài)變化；
（B） 在干旱處理的四個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)五種生理性狀。五個(gè)重復(fù)的顯著差異用不同字母表示（P<0.05，方差分析）
（2）干旱脅迫下差異表達(dá)基因（DEG）的變化
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）分析結(jié)果表明，差異表達(dá)基因（DEG）數(shù)量隨著干旱脅迫的加劇而增加。與T0相比，在T8時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到的DEG最多（5308），其中顯著上調(diào)基因和下調(diào)基因數(shù)量分別為2225和3083（圖2A）。值得注意的是，在T12和T8之間的DEG數(shù)量最少（100個(gè)），表明T8和T12的基因表達(dá)模式相似。使用STEM程序搜索常見(jiàn)的時(shí)間表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)11個(gè)重要的配置文件，其中兩個(gè)寬圖譜在T8時(shí)表現(xiàn)出上調(diào)（1549個(gè)基因）或下調(diào)（1274個(gè)基因）（圖2B）。KEGG富集分析結(jié)果表明，上調(diào)基因在甘油磷脂代謝通路、MAPK信號(hào)和核糖體生物合成中富集，而下調(diào)基因在固碳作用和光合作用中富集（圖2B）。這些基因可能在F.nilgerensis的干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
T8與T0時(shí)間點(diǎn)的DEG進(jìn)行分析，GO富集分析結(jié)果表明，更多通路主要在抗旱性方面富集。上調(diào)基因主要在響應(yīng)水分剝奪、氧化應(yīng)激、脫落酸激活信號(hào)通路、UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性、鈣調(diào)蛋白結(jié)合和活性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性響應(yīng)中富集（圖2C）。下調(diào)基因主要在光合作用、細(xì)胞壁組織或生物發(fā)生、跨膜受體蛋白激酶活性和水通道活性中富集。在T8時(shí)間點(diǎn)參與DEG的主要富集通路大致描繪了F.nilgerrensis抗旱性的基因參與過(guò)程。
圖2：差異表達(dá)基因（DEG）檢測(cè)和功能注釋。
（A） 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上調(diào)和下調(diào)的DEG數(shù)量；
（B） 在干旱第8天（T8）獲得兩個(gè)顯著聚類(lèi)。顯示了兩個(gè)簇的KEGG富集，每個(gè)通路中富集的單基因數(shù)量；
（C） T8和T0之間DEG的前10個(gè)GO富集分析
（3）干旱脅迫下F. nilgerensis的DNA甲基化圖譜變化
為研究干旱脅迫下DNA甲基化水平的調(diào)控機(jī)制，研究人員進(jìn)行了全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）分析。共12個(gè)樣本生成了126Gb clean data，平均每個(gè)樣本10.5Gb，測(cè)序深度＞30×（基因組305.9Mb），唯一比對(duì)率為67.75%~73.13%。最低的Q20和Q30分別為96.78%和90.18%，亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化率在為99.499%~99.782%，表明DNA甲基化reads信息高度可靠。
在F.nilgerensis的三個(gè)序列環(huán)境中，CG、CHG和CHH中表現(xiàn)出的DNA甲基化水平分別為47.69%、30.87%和10.56%（圖3A）。此外， mCG、mCHG和mCHH在總mC位點(diǎn)中的百分比在不同時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化，其中mCHH不僅占最高百分比，而且表現(xiàn)出最大變化（圖3B）。這與之前在桑椹和陸地棉中的研究結(jié)果一致，即CHH甲基化水平隨環(huán)境而動(dòng)態(tài)變化，且CHH甲基化可能與干旱脅迫密切相關(guān)。在干旱脅迫期間，F(xiàn). nilgerensis基因組分和重復(fù)序列的DNA甲基化水平也顯示出CHH甲基化的顯著變化，尤其是在啟動(dòng)子和重復(fù)序列中（圖3C）。
此外還分析每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理組和對(duì)照（T0）之間差異甲基化區(qū)域（DMR）數(shù)，分別在T4和T8檢測(cè)到大量低甲基化和高甲基化DMR（圖3D）。這些DMR主要發(fā)生在CHH環(huán)境中，其中約80%位于重復(fù)元件中。不同基因組區(qū)域中每個(gè)元件的甲基化水平表明，重復(fù)元件在所有三種情況和所有時(shí)間點(diǎn)顯示出最高的甲基化水平，其次是啟動(dòng)子和內(nèi)含子（圖3C）。由于啟動(dòng)子和基因體的甲基化對(duì)基因表達(dá)有不同的影響，將差異甲基化基因（DMG）分為啟動(dòng)子DMG和基因體DMG。結(jié)果表明，在干旱脅迫的所有時(shí)間點(diǎn)，F(xiàn). nilgerrenis的啟動(dòng)子DMG均高于基因體DMG（圖3D）。在啟動(dòng)子DMG中，所有時(shí)間點(diǎn)有317個(gè)低甲基化共有基因和21個(gè)高甲基化共有基因（圖3E），表明這些基因的甲基化水平動(dòng)態(tài)變化，可能直接或間接參與調(diào)控表達(dá)基因?qū)Ω珊得{迫的調(diào)控。KEGG富集分析結(jié)果表明，這些基因主要參與植物激素信號(hào)、MAPK信號(hào)通路和泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路。DMG的KEGG富集分析結(jié)果與DEG的KEGG富集分析結(jié)果大致一致。
圖3：干旱脅迫下四個(gè)時(shí)間點(diǎn)DNA甲基化水平變化。
（A） T8時(shí)間點(diǎn)不同序列背景下的DNA甲基化水平變化。x軸表示甲基化水平，y軸表示總甲基化胞嘧啶位點(diǎn)的分?jǐn)?shù)；
（B） 干旱不同時(shí)間點(diǎn)CG、CHG和CHH環(huán)境中mC相對(duì)比例；
（C） DNA甲基化的動(dòng)態(tài)變化，包括基因組分和重復(fù)序列；
（D） 計(jì)算每個(gè)比較時(shí)間點(diǎn)的差異甲基化區(qū)域（DMR）及其相應(yīng)基因（DMG）數(shù)量；
（E） 對(duì)照組啟動(dòng)子甲基化相關(guān)基因的Upset-Venn圖
（4）干旱脅迫下甲基化水平與基因表達(dá)的關(guān)系
圖4：甲基化組和轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析揭示干旱響應(yīng)基因的表達(dá)調(diào)控。
（A） 不同表達(dá)類(lèi)別的基因組分區(qū)域（基因體及其上游和下游2kb區(qū)域）的甲基化水平：低至高表達(dá)水平對(duì)應(yīng)于FPKM的下/中/上四分位數(shù)，F(xiàn)PKM<1表示無(wú)表達(dá)（none）；
（B） 共有的835個(gè)基因進(jìn)行甲基化組-轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析；
（C） 所有DEG、高甲基化和低甲基化DGE基因表達(dá)水平箱線(xiàn)圖。中間的綠松石點(diǎn)圖表示基因數(shù)量和對(duì)應(yīng)的表達(dá)水平。***P.adj< 0.001（ANOVA，Tukey_HSD）；
（D，E）鑒定啟動(dòng)子和基因體甲基化與835個(gè)基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)。C1：高甲基化和低表達(dá)；C2：低甲基化和高表達(dá)；C3：高甲基化和高表達(dá)；C4：低甲基化和低表達(dá)。
（5）F. nilgerensis干旱響應(yīng)關(guān)鍵基因的表征
圖5：加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）揭示了關(guān)鍵抗旱基因和抗旱模塊的qRT-PCR驗(yàn)證。
（A）F.nilgerrensis在干旱條件下的ABA信號(hào)調(diào)控模型。紅色上下箭頭分別表示基因的上調(diào)和下調(diào)，“Me”表示差異甲基化；PA/DPA：相酸和二氫相酸；
（B） 模塊-性狀相關(guān)性。列對(duì)應(yīng)由不同顏色指示的模塊，行對(duì)應(yīng)干旱生理特性，相交的細(xì)胞數(shù)表示相關(guān)性和P值；
（C） 高度相關(guān)的綠松石模塊的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)。ABA信號(hào)的核心組分基因以“紅色”為特征，權(quán)重以節(jié)點(diǎn)大小為特征，反映了與其相關(guān)的基因數(shù)量；
（D） 通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證了干旱脅迫下響應(yīng)基因的表達(dá)水平。條形圖表示三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的±SD
圖6：F.nilgerrensis的干旱響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。熱圖左側(cè)的綠色條表示發(fā)生差異甲基化。
RuBisco：核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶（Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase）
PPDK：丙酮酸,磷酸二激酶（Pyruvate, phosphate dikinase）
PEPcase：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase）
LEA：成膜晚期豐富蛋白（Late embriogenesis abundant protein ）
FBPase：果糖-1,6-二磷酸酶（Fructose-1,6-bisphosphatase ）
POD：過(guò)氧化物酶（Peroxide Enzyme ）
ROBH：呼吸爆發(fā)氧化酶同源物（Respiratory burst oxidase homolog ）
GST：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（Glutathione transferase ）
GPX：谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase ）
FER：鐵蛋白（Ferritin ）
TRX：硫氧還蛋白（Thioredoxin ）
PIP：水通道蛋白（Aquaporins ）
APX：抗壞血酸過(guò)氧化物酶（Ascorbate peroxidase ）
GR：谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase）
結(jié)論
F. nilgerrensis是提高栽培草莓抗旱性的重要野生來(lái)源。本研究通過(guò)對(duì)DNA甲基化、轉(zhuǎn)錄組和生理性狀的綜合分析，揭示了F.nilgerrensis的干旱響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究結(jié)果表明，ABA依賴(lài)性和非依賴(lài)性信號(hào)通路在F.nilgerrensis的干旱響應(yīng)中發(fā)揮作用。此外，滲透調(diào)控能力和維持ROS再生與清除平衡能力對(duì)于預(yù)防代謝功能障礙至關(guān)重要，且在很大程度上決定了F.nilgerrensis的整體抗旱性。DNA甲基化和基因表達(dá)之間的相關(guān)性更為微妙，在啟動(dòng)子和基因體中都顯示出正相關(guān)和負(fù)相關(guān)，表明DNA甲基化和基因表達(dá)之間存在多種類(lèi)型的關(guān)聯(lián)。綜上所述，本研究為全面探索植物抗旱機(jī)制提供了模型，為育種和作物管理提供了參考。
參考文獻(xiàn)：Cao Q, Huang L, Li J, Qu P, Tao P, Crabbe MJC, Zhang T, Qiao Q. Integrated transcriptome and methylome analyses reveal the molecular regulation of drought stress in wild strawberry (Fragaria nilgerrensis). BMC Plant Biol. 2022 Dec 28;22(1):613.
2022年10月28日，云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院?jiǎn)糖俳淌趫F(tuán)隊(duì)與云南中醫(yī)藥大學(xué)張?bào)w操團(tuán)隊(duì)聯(lián)合在《BMC Plant Biol》雜志發(fā)表題為“Integrated transcriptome and methylome analyses reveal the molecular regulation of drought stress in wild strawberry (Fragaria nilgerrensis)”的研究論文，研究通過(guò)對(duì)黃毛草莓（F. nilgerrensis）干旱脅迫處理過(guò)程中四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)譜、全基因組DNA甲基化圖譜和生理性狀的綜合分析，研究了F. nilgerrensis的干旱響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
標(biāo)題：Integrated transcriptome and methylome analyses reveal the molecular regulation of drought stress in wild strawberry (Fragaria nilgerrensis) 整合轉(zhuǎn)錄組和甲基化組分析揭示了野生草莓干旱脅迫的分子調(diào)控
時(shí)間：2022-10-28
期刊：BMC Plant Biology
影響因子：IF 5.26
技術(shù)平臺(tái)：WGBS、RNA-seq、qRT-PCR分析等
項(xiàng)目設(shè)計(jì)：
采集同一克隆的F. nilgerrensis野生草莓作為實(shí)驗(yàn)材料，在溫室中進(jìn)行干旱處理實(shí)驗(yàn)，分為對(duì)照組和處理組：（i）對(duì)照組：每2天澆水一次；（ii）干旱處理組：植物從0d到12d沒(méi)有澆水。在持續(xù)干旱脅迫處理期間的四個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集F. nilgerrensis葉片：0d（T0，CK），4d（T4），8d（T8）和12d（T12）（圖1A）。在干旱脅迫下的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的上午9點(diǎn)~10點(diǎn)之間對(duì)葉片進(jìn)行取樣，立即在液氮中冷凍，-80℃保存。在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得的葉片用于DNA甲基化分析（WGBS）、轉(zhuǎn)錄組分析(RNA-seq)和qRT-PCR分析的材料，，實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。
結(jié)果圖形
（1）干旱脅迫下F. nilgerrensis的生理性狀
圖1：干旱脅迫實(shí)驗(yàn)材料（A） F.nilgerrensis對(duì)干旱響應(yīng)的形態(tài)變化；
（B） 在干旱處理的四個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)五種生理性狀。五個(gè)重復(fù)的顯著差異用不同字母表示（P<0.05，方差分析）
（2）干旱脅迫下差異表達(dá)基因（DEG）的變化
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）分析結(jié)果表明，差異表達(dá)基因（DEG）數(shù)量隨著干旱脅迫的加劇而增加。與T0相比，在T8時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到的DEG最多（5308），其中顯著上調(diào)基因和下調(diào)基因數(shù)量分別為2225和3083（圖2A）。值得注意的是，在T12和T8之間的DEG數(shù)量最少（100個(gè)），表明T8和T12的基因表達(dá)模式相似。使用STEM程序搜索常見(jiàn)的時(shí)間表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)11個(gè)重要的配置文件，其中兩個(gè)寬圖譜在T8時(shí)表現(xiàn)出上調(diào)（1549個(gè)基因）或下調(diào)（1274個(gè)基因）（圖2B）。KEGG富集分析結(jié)果表明，上調(diào)基因在甘油磷脂代謝通路、MAPK信號(hào)和核糖體生物合成中富集，而下調(diào)基因在固碳作用和光合作用中富集（圖2B）。這些基因可能在F.nilgerensis的干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
T8與T0時(shí)間點(diǎn)的DEG進(jìn)行分析，GO富集分析結(jié)果表明，更多通路主要在抗旱性方面富集。上調(diào)基因主要在響應(yīng)水分剝奪、氧化應(yīng)激、脫落酸激活信號(hào)通路、UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性、鈣調(diào)蛋白結(jié)合和活性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性響應(yīng)中富集（圖2C）。下調(diào)基因主要在光合作用、細(xì)胞壁組織或生物發(fā)生、跨膜受體蛋白激酶活性和水通道活性中富集。在T8時(shí)間點(diǎn)參與DEG的主要富集通路大致描繪了F.nilgerrensis抗旱性的基因參與過(guò)程。
圖2：差異表達(dá)基因（DEG）檢測(cè)和功能注釋。
（A） 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上調(diào)和下調(diào)的DEG數(shù)量；
（B） 在干旱第8天（T8）獲得兩個(gè)顯著聚類(lèi)。顯示了兩個(gè)簇的KEGG富集，每個(gè)通路中富集的單基因數(shù)量；
（C） T8和T0之間DEG的前10個(gè)GO富集分析
（3）干旱脅迫下F. nilgerensis的DNA甲基化圖譜變化
為研究干旱脅迫下DNA甲基化水平的調(diào)控機(jī)制，研究人員進(jìn)行了全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）分析。共12個(gè)樣本生成了126Gb clean data，平均每個(gè)樣本10.5Gb，測(cè)序深度＞30×（基因組305.9Mb），唯一比對(duì)率為67.75%~73.13%。最低的Q20和Q30分別為96.78%和90.18%，亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化率在為99.499%~99.782%，表明DNA甲基化reads信息高度可靠。
在F.nilgerensis的三個(gè)序列環(huán)境中，CG、CHG和CHH中表現(xiàn)出的DNA甲基化水平分別為47.69%、30.87%和10.56%（圖3A）。此外， mCG、mCHG和mCHH在總mC位點(diǎn)中的百分比在不同時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化，其中mCHH不僅占最高百分比，而且表現(xiàn)出最大變化（圖3B）。這與之前在桑椹和陸地棉中的研究結(jié)果一致，即CHH甲基化水平隨環(huán)境而動(dòng)態(tài)變化，且CHH甲基化可能與干旱脅迫密切相關(guān)。在干旱脅迫期間，F(xiàn). nilgerensis基因組分和重復(fù)序列的DNA甲基化水平也顯示出CHH甲基化的顯著變化，尤其是在啟動(dòng)子和重復(fù)序列中（圖3C）。
此外還分析每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理組和對(duì)照（T0）之間差異甲基化區(qū)域（DMR）數(shù)，分別在T4和T8檢測(cè)到大量低甲基化和高甲基化DMR（圖3D）。這些DMR主要發(fā)生在CHH環(huán)境中，其中約80%位于重復(fù)元件中。不同基因組區(qū)域中每個(gè)元件的甲基化水平表明，重復(fù)元件在所有三種情況和所有時(shí)間點(diǎn)顯示出最高的甲基化水平，其次是啟動(dòng)子和內(nèi)含子（圖3C）。由于啟動(dòng)子和基因體的甲基化對(duì)基因表達(dá)有不同的影響，將差異甲基化基因（DMG）分為啟動(dòng)子DMG和基因體DMG。結(jié)果表明，在干旱脅迫的所有時(shí)間點(diǎn)，F(xiàn). nilgerrenis的啟動(dòng)子DMG均高于基因體DMG（圖3D）。在啟動(dòng)子DMG中，所有時(shí)間點(diǎn)有317個(gè)低甲基化共有基因和21個(gè)高甲基化共有基因（圖3E），表明這些基因的甲基化水平動(dòng)態(tài)變化，可能直接或間接參與調(diào)控表達(dá)基因?qū)Ω珊得{迫的調(diào)控。KEGG富集分析結(jié)果表明，這些基因主要參與植物激素信號(hào)、MAPK信號(hào)通路和泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路。DMG的KEGG富集分析結(jié)果與DEG的KEGG富集分析結(jié)果大致一致。
圖3：干旱脅迫下四個(gè)時(shí)間點(diǎn)DNA甲基化水平變化。（A） T8時(shí)間點(diǎn)不同序列背景下的DNA甲基化水平變化。x軸表示甲基化水平，y軸表示總甲基化胞嘧啶位點(diǎn)的分?jǐn)?shù)；
（B） 干旱不同時(shí)間點(diǎn)CG、CHG和CHH環(huán)境中mC相對(duì)比例；
（C） DNA甲基化的動(dòng)態(tài)變化，包括基因組分和重復(fù)序列；
（D） 計(jì)算每個(gè)比較時(shí)間點(diǎn)的差異甲基化區(qū)域（DMR）及其相應(yīng)基因（DMG）數(shù)量；
（E） 對(duì)照組啟動(dòng)子甲基化相關(guān)基因的Upset-Venn圖
（4）干旱脅迫下甲基化水平與基因表達(dá)的關(guān)系
圖4：甲基化組和轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析揭示干旱響應(yīng)基因的表達(dá)調(diào)控。（A） 不同表達(dá)類(lèi)別的基因組分區(qū)域（基因體及其上游和下游2kb區(qū)域）的甲基化水平：低至高表達(dá)水平對(duì)應(yīng)于FPKM的下/中/上四分位數(shù)，F(xiàn)PKM<1表示無(wú)表達(dá)（none）；
（B） 共有的835個(gè)基因進(jìn)行甲基化組-轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析；
（C） 所有DEG、高甲基化和低甲基化DGE基因表達(dá)水平箱線(xiàn)圖。中間的綠松石點(diǎn)圖表示基因數(shù)量和對(duì)應(yīng)的表達(dá)水平。***P.adj< 0.001（ANOVA，Tukey_HSD）；
（D，E）鑒定啟動(dòng)子和基因體甲基化與835個(gè)基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)。C1：高甲基化和低表達(dá)；C2：低甲基化和高表達(dá)；C3：高甲基化和高表達(dá)；C4：低甲基化和低表達(dá)。
（5）F. nilgerensis干旱響應(yīng)關(guān)鍵基因的表征
圖5：加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）揭示了關(guān)鍵抗旱基因和抗旱模塊的qRT-PCR驗(yàn)證。（A）F.nilgerrensis在干旱條件下的ABA信號(hào)調(diào)控模型。紅色上下箭頭分別表示基因的上調(diào)和下調(diào)，“Me”表示差異甲基化；PA/DPA：相酸和二氫相酸；
（B） 模塊-性狀相關(guān)性。列對(duì)應(yīng)由不同顏色指示的模塊，行對(duì)應(yīng)干旱生理特性，相交的細(xì)胞數(shù)表示相關(guān)性和P值；
（C） 高度相關(guān)的綠松石模塊的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)。ABA信號(hào)的核心組分基因以“紅色”為特征，權(quán)重以節(jié)點(diǎn)大小為特征，反映了與其相關(guān)的基因數(shù)量；
（D） 通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證了干旱脅迫下響應(yīng)基因的表達(dá)水平。條形圖表示三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的±SD
圖6：F.nilgerrensis的干旱響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。熱圖左側(cè)的綠色條表示發(fā)生差異甲基化。RuBisco：核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶（Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase）
PPDK：丙酮酸,磷酸二激酶（Pyruvate, phosphate dikinase）
PEPcase：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase）
LEA：成膜晚期豐富蛋白（Late embriogenesis abundant protein ）
FBPase：果糖-1,6-二磷酸酶（Fructose-1,6-bisphosphatase ）
POD：過(guò)氧化物酶（Peroxide Enzyme ）
ROBH：呼吸爆發(fā)氧化酶同源物（Respiratory burst oxidase homolog ）
GST：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（Glutathione transferase ）
GPX：谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase ）
FER：鐵蛋白（Ferritin ）
TRX：硫氧還蛋白（Thioredoxin ）
PIP：水通道蛋白（Aquaporins ）
APX：抗壞血酸過(guò)氧化物酶（Ascorbate peroxidase ）
GR：谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase）
結(jié)論
F. nilgerrensis是提高栽培草莓抗旱性的重要野生來(lái)源。本研究通過(guò)對(duì)DNA甲基化、轉(zhuǎn)錄組和生理性狀的綜合分析，揭示了F.nilgerrensis的干旱響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究結(jié)果表明，ABA依賴(lài)性和非依賴(lài)性信號(hào)通路在F.nilgerrensis的干旱響應(yīng)中發(fā)揮作用。此外，滲透調(diào)控能力和維持ROS再生與清除平衡能力對(duì)于預(yù)防代謝功能障礙至關(guān)重要，且在很大程度上決定了F.nilgerrensis的整體抗旱性。DNA甲基化和基因表達(dá)之間的相關(guān)性更為微妙，在啟動(dòng)子和基因體中都顯示出正相關(guān)和負(fù)相關(guān)，表明DNA甲基化和基因表達(dá)之間存在多種類(lèi)型的關(guān)聯(lián)。綜上所述，本研究為全面探索植物抗旱機(jī)制提供了模型，為育種和作物管理提供了參考。
參考文獻(xiàn)：Cao Q, Huang L, Li J, Qu P, Tao P, Crabbe MJC, Zhang T, Qiao Q. Integrated transcriptome and methylome analyses reveal the molecular regulation of drought stress in wild strawberry (Fragaria nilgerrensis). BMC Plant Biol. 2022 Dec 28;22(1):613.
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