m5C高甲基化介導(dǎo)EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌耐藥潛在機(jī)理
對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）的固有耐藥（Intrinsic resistance）和獲得耐藥(acquired resistance)是EGFR突變型非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者治療失敗的主要原因，然而EGFR-TKI的固有耐藥性背后的機(jī)制在很大程度上仍然未知。
5-甲基胞嘧啶（m5C）是哺乳動(dòng)物mRNA的重要轉(zhuǎn)錄后修飾，其由NOP2/Sun結(jié)構(gòu)域（NSUN）RNA甲基轉(zhuǎn)移酶或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶2（DNMT2）催化，并可通過TET甲基胞嘧啶雙加氧酶2（TET2）去甲基化。Aly/REF出核因子（ALYREF）識(shí)別m5C修飾的mRNA以促進(jìn)mRNA出核，而Y盒結(jié)合蛋白1（YBX1）直接結(jié)合m5C甲基化的mRNA以穩(wěn)定mRNA。m5C異常修飾與膀胱癌、胃癌和食管鱗癌的發(fā)病和發(fā)展有關(guān)。m5C修飾在各種腫瘤的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，然而RNA m5C修飾在腫瘤耐藥性中的作用和分子機(jī)制尚不清楚。
2023年05月09日，鄭州大學(xué)田鑫教授團(tuán)隊(duì)、闞全程教授團(tuán)隊(duì)與中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所楊運(yùn)桂團(tuán)隊(duì)合作在《Molecular Cancer》雜志上發(fā)表題為“Aberrant m5C hypermethylation mediates intrinsic resistance to gefitinib through NSUN2/YBX1/QSOX1 axis in EGFR-mutant non-small-cell lung cancer”的研究論文，該研究揭示了通過NSUN2-YBX1-QSOX1軸的異常RNA m5C修飾在介導(dǎo)EGFR突變型NSCLC對(duì)吉非替尼固有耐藥性中的關(guān)鍵功能。
標(biāo)題：Aberrant m5C hypermethylation mediates intrinsic resistance to gefitinib through NSUN2/YBX1/QSOX1 axis in EGFR-mutant non-small-cell lung cancer（在EGFR突變型非小細(xì)胞肺癌中，異常m5C高甲基化通過NSUN2/YBX1/QSOX1軸介導(dǎo)對(duì)吉非替尼的固有耐藥）
時(shí)間：2023.05.09
期刊：Molecular Cancer
影響因子：IF 41.444
技術(shù)平臺(tái)：功能實(shí)驗(yàn)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、RNA-BS、mRNA-seq、MeRIP-qPCR、Western blot等
樣本：人肺腺癌細(xì)胞系PC-9、HCC827、HCC2935、HCC4006、H1650、HCC2279、H1975細(xì)胞，藥物敏感或固有耐藥EGFR-TKI的NSCLC患者肺腺癌組織
研究摘要：
該研究通過在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞系和患者樣本中檢測(cè)RNA m5C甲基化、m5C writer NOP2/Sun RNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員2（NSUN2）與EGFR-TKI耐藥的相關(guān)性。通過體外和體內(nèi)功能獲得實(shí)驗(yàn)和功能喪失試驗(yàn)研究了NSUN2對(duì)EGFR-TKI耐藥性的影響。通過RNA測(cè)序（RNA-seq）、亞硫酸鹽RNA測(cè)序（RNA-BS）和m5C甲基化RNA免疫沉淀qPCR（MeRIP-qPCR）鑒定NSUN2參與EGFR-TKI耐藥的靶基因。此外，通過功能拯救實(shí)驗(yàn)和嘌呤霉素?fù)饺雽?shí)驗(yàn)研究了NSUN2對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。
結(jié)果表明，RNA m5C高甲基化和NSUN2與EGFR-TKI的固有耐藥性顯著相關(guān)。NSUN2過表達(dá)導(dǎo)致吉非替尼耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)，而NSUN2基因抑制導(dǎo)致腫瘤消退，并在體外和體內(nèi)克服了對(duì)吉非替尼的固有耐藥性。整合RNA-seq和m5C-BS分析結(jié)果，表明QSOX1（quiescin sulfhydryl oxidase 1）是m5C異常修飾的潛在靶點(diǎn)。NSUN2甲基化QSOX1編碼序列區(qū)域，通過m5C readers Y-box結(jié)合蛋白1（YBX1）增強(qiáng)QSOX1翻譯。NSUN2-YBX1-QSOX1通路的基因沉默克服了非小細(xì)胞肺癌中固有的吉非替尼耐藥性。本研究揭示了先前未被識(shí)別的NSUN2-YBX1-QSOX1軸信號(hào)在對(duì)EGFR-TKI固有耐藥的NSCLC患者的預(yù)后和治療中的作用。
研究結(jié)果：
（1）m5C高甲基化和NSUN2與吉非替尼固有耐藥性相關(guān)
圖1：m5C高甲基化和NSUN2穩(wěn)定表達(dá)與NSCLC吉非替尼的固有耐藥相關(guān)
a. 以梯度濃度的吉非替尼或奧希替尼處理NSCLC細(xì)胞72 h，并用CCK-8法檢測(cè)其IC50值。
b. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細(xì)胞24 h，ELISA法檢測(cè)mRNA m5C水平。
c. 吉非替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細(xì)胞24 h，繪制微陣列分析中RNA m5C甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的基因表達(dá)熱圖。
d. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細(xì)胞24 h， qRT-PCR檢測(cè)NSUN2 mRNA表達(dá)。
e. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細(xì)胞24 h后，用相應(yīng)抗體進(jìn)行western blot分析全細(xì)胞裂解物。
f-g. 吉非替尼固有耐藥的NSCLC患者NSUN2和p-EGFR的IHC染色代表性圖像(f)和治療前后活檢的定量H-scores評(píng)分(g)。
h. TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集中NSUN2與耐藥標(biāo)志物或抑癌基因的相關(guān)性基因表達(dá)分析。
數(shù)據(jù)為三次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。Ns（不顯著），Ctrl（對(duì)照），Gef（吉非替尼），Osi（奧希替尼），*p < 0.05， **p < 0.01。
（2）NSUN2過表達(dá)促進(jìn)吉非替尼體內(nèi)和體外耐藥
圖2：NSUN2過表達(dá)導(dǎo)致吉非替尼耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)
a. 對(duì)PC-9細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染野生型NSUN2 (NSUN2-WT)、雙催化突變型NSUN2 (NSUN2-DM)和空載體質(zhì)粒(Mock)的 NSUN2表達(dá)進(jìn)行western blot分析。
b. 以梯度濃度吉非替尼處理PC-9-Mock、PC-9-NSUN2-WT、PC-9-NSUN2-DM細(xì)胞72 h，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力及吉非替尼IC50。
c. 吉非替尼(1µM)處理PC-9-Mock、PC-9-NSUN2-WT、PC-9-NSUN2-DM細(xì)胞24 h后，western blot分析NSUN2蛋白水平。
d-f. BALB/c裸鼠皮下植入PC-9-Mock、PC-9-NSUN2-WT、PC-9-NSUN2-DM細(xì)胞(每組n≥6個(gè))的腫瘤體積(d)、腫瘤重量(e)和小鼠生存期(f)。注射后約2周，分別給予吉非替尼25 mg/kg或0.5% CMC-Na灌胃，1次/ d，連續(xù)10 d(第15~24天)。
g. 從腫瘤異種移植獲得的腫瘤ki67 IHC染色和定量H-scores評(píng)分代表性圖像。
（3）NSUN2敲除可克服吉非替尼固有耐藥
圖3：NSUN2敲除在體外和體內(nèi)克服了吉非替尼的固有耐藥性。
a. 將靶向NSUN2 siRNA（siNSUN2）轉(zhuǎn)染或非靶向?qū)φ誷iRNA（siCtrl）轉(zhuǎn)染的H1650和H1975細(xì)胞用吉非替尼（1µM）處理72 h，并通過CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，NSUN2敲除效果使用western blot進(jìn)行評(píng)估分析（上圖）。
b. 用吉非替尼(1µM)處理轉(zhuǎn)染siNSUN2或siCtrl的H1650和H1975細(xì)胞72 h, 通過Annexin V-FITC/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡;
c. H1650細(xì)胞轉(zhuǎn)染siNSUN2或shNSUN2后，western blot分析檢測(cè)EGFR蛋白表達(dá)。
d-e. 經(jīng)shNSUN2預(yù)處理的H1650和H1975細(xì)胞用NSUN2-WT或NSUN2-DM穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，通過CCK-8 (d)或克隆形成實(shí)驗(yàn)(e)檢測(cè)細(xì)胞增殖，通過western blot (右圖)分析NSUN2的拯救效果。
f-g. 皮下植入H1650-shCtrl和H1650-shNSUN2細(xì)胞的BALB/c裸鼠獲得的腫瘤異種移植物的平均體積(f)和腫瘤重量(g)（每組n=7）。
h-i. 皮下植入小鼠模型中H1975-shCtrl和h1975 - shnsun2來源的腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)曲線(h)和平均腫瘤重量(i)(每組n =6)。
（4）YBX1可以作為m5C reader提高吉非替尼耐藥性
圖4：m5C reader YBX1表達(dá)是吉非替尼固有耐藥所必需的
a. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細(xì)胞24 h, western blot檢測(cè)YBX1蛋白表達(dá)水平。
b. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細(xì)胞24 h后，qRT-PCR檢測(cè)YBX1 mRNA表達(dá)。c-d. 吉非替尼固有耐藥的NSCLC患者治療前后活檢YBX1 的IHC染色（c）和定量H-scores評(píng)分（d）。
e-f. 以吉非替尼(1µM)處理轉(zhuǎn)染YBX1 siRNA的H1650和H1975細(xì)胞72 h，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力(e)， Annexin V-FITC/PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡(f)。
g. western blot檢測(cè)siYBX1轉(zhuǎn)染H1975細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)。
h-i. 將shYBX1預(yù)處理的H1650細(xì)胞用野生型YBX1（YBX1-WT）或結(jié)合缺陷突變型YBX1 (YBX1- Mut, W65A) 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，并通過CCK-8 (h)或集落形成實(shí)驗(yàn)(i)檢測(cè)細(xì)胞增殖。
j-k. 皮下植入BALB/c裸鼠從H1650-shCtrl和H1650-shYBX1異種移植物的腫瘤生長(zhǎng)（j）和腫瘤重量（k）（n ≥ 5)。
l. 從H1650-shCtrl和H1650-shYBX1異種移植物獲得的腫瘤ki67 IHC染色和定量H-scores評(píng)分代表性圖像。
（5）QSOX1被鑒定為NSUN2介導(dǎo)的m5C高甲基化的潛在靶點(diǎn)
圖5：表觀轉(zhuǎn)錄組分析鑒定QSOX1是耐藥NSCLC細(xì)胞中m5C修飾的靶標(biāo)。
a-b. H1650細(xì)胞（a）和PC-9細(xì)胞（b）siNSUN2轉(zhuǎn)染72h或吉非替尼（1µM）處理24h后，通過RNA-BS分析m5C平均水平。
c. m5C在對(duì)照組、NSUN2敲低組和吉非替尼處理組的H1650細(xì)胞不同區(qū)域分布。
d. H1650 siNSUN2#1細(xì)胞中m5C甲基化水平和mRNA表達(dá)水平發(fā)生顯著變化。
e. 維恩圖顯示了直接靶向NSUN2的潛在m5C修飾候選基因。
f-g. IGV分析顯示，NSUN2敲低或吉非替尼處理后，H1650 細(xì)胞(f)和PC-9細(xì)胞 (g)中QSOX1的mRNA表達(dá)和m5C水平發(fā)生變化。
h-j. 用抗m5C抗體免疫共沉淀純化mRNA, qRT-PCR分析H1650 (h)、H1975 (i)和HCC2279 (j)中QSOX1的m5C水平。
（6）NSUN2以m5C-YBX1依賴的方式調(diào)控QSOX1 mRNA翻譯
圖6：NSUN2和YBX1通過調(diào)控mRNA翻譯來調(diào)節(jié)QSOX1表達(dá)
a. 用siNSUN2或siCtrl轉(zhuǎn)染H1650和H1975細(xì)胞72 h后，用相應(yīng)抗體western blot分析全細(xì)胞裂解物。
b. 從H1650-shCtrl和H1650-shNSUN2異種移植物獲得的腫瘤QSOX1 IHC染色和定量H-scores評(píng)分代表性圖像。
c. 用siNSUN2預(yù)處理的H1650細(xì)胞用pcDNA-NSUN2-WT或pcDNA-NSUN2-Mut (C271A&C321A)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，western blot分析QSOX1表達(dá)。
d. 用200 nM嘌呤霉素處理siCtrl或siNSUN2轉(zhuǎn)染的H1650或H1975細(xì)胞，用相應(yīng)抗體western blot分析分析全細(xì)胞裂解物。
e. 將含有野生型或突變型(C-to-T/A突變) m5C位點(diǎn)的QSOX1 CDS克隆到熒光素酶報(bào)告載體中。
f. 分別轉(zhuǎn)染shCtrl和shNSUN2的H1650細(xì)胞中，野生型和突變型QSOX1 CDS報(bào)告載體的相對(duì)熒光素酶活性。
g. western blot分析siCtrl和siYBX1轉(zhuǎn)染的H1650和H1975細(xì)胞中QSOX1表達(dá)。
h. 以IgG為對(duì)照，用抗YBX1抗體在siCtrl或siNSUN2轉(zhuǎn)染的H1650細(xì)胞中進(jìn)行YBX1和QSOX1 mRNA免疫共沉淀。
i. 經(jīng)shYBX1預(yù)處理的H1650細(xì)胞用3FLAG-YBX1-WT或3FLAG-YBX1-Mut (W65A)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，western blot分析QSOX1表達(dá)。
j. 用200 nM嘌呤霉素處理siCtrl或siYBX1轉(zhuǎn)染的H1650或H1975細(xì)胞，用相應(yīng)抗體進(jìn)行western blot分析全細(xì)胞裂解物。
k. H1650細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染shCtrl和shYBX1后，野生型和突變型QSOX1 CDS報(bào)告載體的相對(duì)熒光素酶活性。l. 用siNSUN2或siYBX1單獨(dú)或聯(lián)合轉(zhuǎn)染H1650細(xì)胞72 h后，用相應(yīng)抗體western blot分析全細(xì)胞裂解物。
（7）QSOX1與吉非替尼固有耐藥性相關(guān)
c. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細(xì)胞24 h, western blot分析QSOX1蛋白表達(dá)水平。
d. 用吉非替尼(1µM)處理經(jīng)靶向QSOX1（siQSOX1）或非靶向?qū)φ眨╯iCtrl）siRNA轉(zhuǎn)染的H1650和H1975細(xì)胞72 h，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。
e-f. 經(jīng)shNSUN2預(yù)處理的H1650細(xì)胞m5C位點(diǎn)用野生型QSOX1 (QSOX1-WT)或突變型QSOX1 (QSOX1-Mut)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，采用CCK-8 (e)或集落形成實(shí)驗(yàn)(f)檢測(cè)細(xì)胞增殖。
g-h. BALB/c裸鼠皮下移植H1975-shCtrl和H1975-shQSOX1細(xì)胞異種移植物的的腫瘤生長(zhǎng)曲線(g)和腫瘤重量(h) (每組n=7)。
i. TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集的Kaplan-Meier分析顯示NSUN2、YBX1和QSOX1聯(lián)合高表達(dá)預(yù)測(cè)較差的總生存率。采用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)確定P值(P=0.016)。
j. 非小細(xì)胞肺癌中異常m5C高甲基化通過NSUN2/YBX1/QSOX1軸導(dǎo)致吉非替尼固有耐藥性的工作模型。
結(jié)論
本研究表明，NSUN2-YBX1-QSOX1軸是調(diào)控NSCLC對(duì)EGFR-TKI固有耐藥性的重要機(jī)制。抑制NSUN2-YBX1-QSOX1軸可以通過m5C依賴性調(diào)節(jié)機(jī)制克服吉非替尼的固有耐藥性。研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了NSUN2-YBX1-QSOX1軸可以作為EGFR-TKI固有耐藥的NSCLC患者預(yù)后和治療的候選生物標(biāo)志物。
參考文獻(xiàn)：
Wang Y, Wei J, Feng L, Li O, Huang L, Zhou S, Xu Y, An K, Zhang Y, Chen R, He L, Wang Q, Wang H, Du Y, Liu R, Huang C, Zhang X, Yang YG, Kan Q, Tian X. Aberrant m5C hypermethylation mediates intrinsic resistance to gefitinib through NSUN2/YBX1/QSOX1 axis in EGFR-mutant non-small-cell lung cancer. Mol Cancer. 2023 May 9;22(1):81.
5-甲基胞嘧啶（m5C）是哺乳動(dòng)物mRNA的重要轉(zhuǎn)錄后修飾，其由NOP2/Sun結(jié)構(gòu)域（NSUN）RNA甲基轉(zhuǎn)移酶或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶2（DNMT2）催化，并可通過TET甲基胞嘧啶雙加氧酶2（TET2）去甲基化。Aly/REF出核因子（ALYREF）識(shí)別m5C修飾的mRNA以促進(jìn)mRNA出核，而Y盒結(jié)合蛋白1（YBX1）直接結(jié)合m5C甲基化的mRNA以穩(wěn)定mRNA。m5C異常修飾與膀胱癌、胃癌和食管鱗癌的發(fā)病和發(fā)展有關(guān)。m5C修飾在各種腫瘤的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，然而RNA m5C修飾在腫瘤耐藥性中的作用和分子機(jī)制尚不清楚。
2023年05月09日，鄭州大學(xué)田鑫教授團(tuán)隊(duì)、闞全程教授團(tuán)隊(duì)與中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所楊運(yùn)桂團(tuán)隊(duì)合作在《Molecular Cancer》雜志上發(fā)表題為“Aberrant m5C hypermethylation mediates intrinsic resistance to gefitinib through NSUN2/YBX1/QSOX1 axis in EGFR-mutant non-small-cell lung cancer”的研究論文，該研究揭示了通過NSUN2-YBX1-QSOX1軸的異常RNA m5C修飾在介導(dǎo)EGFR突變型NSCLC對(duì)吉非替尼固有耐藥性中的關(guān)鍵功能。
標(biāo)題：Aberrant m5C hypermethylation mediates intrinsic resistance to gefitinib through NSUN2/YBX1/QSOX1 axis in EGFR-mutant non-small-cell lung cancer（在EGFR突變型非小細(xì)胞肺癌中，異常m5C高甲基化通過NSUN2/YBX1/QSOX1軸介導(dǎo)對(duì)吉非替尼的固有耐藥）
時(shí)間：2023.05.09
期刊：Molecular Cancer
影響因子：IF 41.444
技術(shù)平臺(tái)：功能實(shí)驗(yàn)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、RNA-BS、mRNA-seq、MeRIP-qPCR、Western blot等
樣本：人肺腺癌細(xì)胞系PC-9、HCC827、HCC2935、HCC4006、H1650、HCC2279、H1975細(xì)胞，藥物敏感或固有耐藥EGFR-TKI的NSCLC患者肺腺癌組織
研究摘要：
該研究通過在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞系和患者樣本中檢測(cè)RNA m5C甲基化、m5C writer NOP2/Sun RNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員2（NSUN2）與EGFR-TKI耐藥的相關(guān)性。通過體外和體內(nèi)功能獲得實(shí)驗(yàn)和功能喪失試驗(yàn)研究了NSUN2對(duì)EGFR-TKI耐藥性的影響。通過RNA測(cè)序（RNA-seq）、亞硫酸鹽RNA測(cè)序（RNA-BS）和m5C甲基化RNA免疫沉淀qPCR（MeRIP-qPCR）鑒定NSUN2參與EGFR-TKI耐藥的靶基因。此外，通過功能拯救實(shí)驗(yàn)和嘌呤霉素?fù)饺雽?shí)驗(yàn)研究了NSUN2對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。
結(jié)果表明，RNA m5C高甲基化和NSUN2與EGFR-TKI的固有耐藥性顯著相關(guān)。NSUN2過表達(dá)導(dǎo)致吉非替尼耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)，而NSUN2基因抑制導(dǎo)致腫瘤消退，并在體外和體內(nèi)克服了對(duì)吉非替尼的固有耐藥性。整合RNA-seq和m5C-BS分析結(jié)果，表明QSOX1（quiescin sulfhydryl oxidase 1）是m5C異常修飾的潛在靶點(diǎn)。NSUN2甲基化QSOX1編碼序列區(qū)域，通過m5C readers Y-box結(jié)合蛋白1（YBX1）增強(qiáng)QSOX1翻譯。NSUN2-YBX1-QSOX1通路的基因沉默克服了非小細(xì)胞肺癌中固有的吉非替尼耐藥性。本研究揭示了先前未被識(shí)別的NSUN2-YBX1-QSOX1軸信號(hào)在對(duì)EGFR-TKI固有耐藥的NSCLC患者的預(yù)后和治療中的作用。
研究結(jié)果：
（1）m5C高甲基化和NSUN2與吉非替尼固有耐藥性相關(guān)
圖1：m5C高甲基化和NSUN2穩(wěn)定表達(dá)與NSCLC吉非替尼的固有耐藥相關(guān)
b. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細(xì)胞24 h，ELISA法檢測(cè)mRNA m5C水平。
c. 吉非替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細(xì)胞24 h，繪制微陣列分析中RNA m5C甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的基因表達(dá)熱圖。
d. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細(xì)胞24 h， qRT-PCR檢測(cè)NSUN2 mRNA表達(dá)。
e. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細(xì)胞24 h后，用相應(yīng)抗體進(jìn)行western blot分析全細(xì)胞裂解物。
f-g. 吉非替尼固有耐藥的NSCLC患者NSUN2和p-EGFR的IHC染色代表性圖像(f)和治療前后活檢的定量H-scores評(píng)分(g)。
h. TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集中NSUN2與耐藥標(biāo)志物或抑癌基因的相關(guān)性基因表達(dá)分析。
數(shù)據(jù)為三次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。Ns（不顯著），Ctrl（對(duì)照），Gef（吉非替尼），Osi（奧希替尼），*p < 0.05， **p < 0.01。
（2）NSUN2過表達(dá)促進(jìn)吉非替尼體內(nèi)和體外耐藥
圖2：NSUN2過表達(dá)導(dǎo)致吉非替尼耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)
b. 以梯度濃度吉非替尼處理PC-9-Mock、PC-9-NSUN2-WT、PC-9-NSUN2-DM細(xì)胞72 h，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力及吉非替尼IC50。
c. 吉非替尼(1µM)處理PC-9-Mock、PC-9-NSUN2-WT、PC-9-NSUN2-DM細(xì)胞24 h后，western blot分析NSUN2蛋白水平。
d-f. BALB/c裸鼠皮下植入PC-9-Mock、PC-9-NSUN2-WT、PC-9-NSUN2-DM細(xì)胞(每組n≥6個(gè))的腫瘤體積(d)、腫瘤重量(e)和小鼠生存期(f)。注射后約2周，分別給予吉非替尼25 mg/kg或0.5% CMC-Na灌胃，1次/ d，連續(xù)10 d(第15~24天)。
g. 從腫瘤異種移植獲得的腫瘤ki67 IHC染色和定量H-scores評(píng)分代表性圖像。
（3）NSUN2敲除可克服吉非替尼固有耐藥
圖3：NSUN2敲除在體外和體內(nèi)克服了吉非替尼的固有耐藥性。
b. 用吉非替尼(1µM)處理轉(zhuǎn)染siNSUN2或siCtrl的H1650和H1975細(xì)胞72 h, 通過Annexin V-FITC/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡;
c. H1650細(xì)胞轉(zhuǎn)染siNSUN2或shNSUN2后，western blot分析檢測(cè)EGFR蛋白表達(dá)。
d-e. 經(jīng)shNSUN2預(yù)處理的H1650和H1975細(xì)胞用NSUN2-WT或NSUN2-DM穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，通過CCK-8 (d)或克隆形成實(shí)驗(yàn)(e)檢測(cè)細(xì)胞增殖，通過western blot (右圖)分析NSUN2的拯救效果。
f-g. 皮下植入H1650-shCtrl和H1650-shNSUN2細(xì)胞的BALB/c裸鼠獲得的腫瘤異種移植物的平均體積(f)和腫瘤重量(g)（每組n=7）。
h-i. 皮下植入小鼠模型中H1975-shCtrl和h1975 - shnsun2來源的腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)曲線(h)和平均腫瘤重量(i)(每組n =6)。
（4）YBX1可以作為m5C reader提高吉非替尼耐藥性
圖4：m5C reader YBX1表達(dá)是吉非替尼固有耐藥所必需的
b. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細(xì)胞24 h后，qRT-PCR檢測(cè)YBX1 mRNA表達(dá)。c-d. 吉非替尼固有耐藥的NSCLC患者治療前后活檢YBX1 的IHC染色（c）和定量H-scores評(píng)分（d）。
e-f. 以吉非替尼(1µM)處理轉(zhuǎn)染YBX1 siRNA的H1650和H1975細(xì)胞72 h，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力(e)， Annexin V-FITC/PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡(f)。
g. western blot檢測(cè)siYBX1轉(zhuǎn)染H1975細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)。
h-i. 將shYBX1預(yù)處理的H1650細(xì)胞用野生型YBX1（YBX1-WT）或結(jié)合缺陷突變型YBX1 (YBX1- Mut, W65A) 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，并通過CCK-8 (h)或集落形成實(shí)驗(yàn)(i)檢測(cè)細(xì)胞增殖。
j-k. 皮下植入BALB/c裸鼠從H1650-shCtrl和H1650-shYBX1異種移植物的腫瘤生長(zhǎng)（j）和腫瘤重量（k）（n ≥ 5)。
l. 從H1650-shCtrl和H1650-shYBX1異種移植物獲得的腫瘤ki67 IHC染色和定量H-scores評(píng)分代表性圖像。
（5）QSOX1被鑒定為NSUN2介導(dǎo)的m5C高甲基化的潛在靶點(diǎn)
圖5：表觀轉(zhuǎn)錄組分析鑒定QSOX1是耐藥NSCLC細(xì)胞中m5C修飾的靶標(biāo)。
a-b. H1650細(xì)胞（a）和PC-9細(xì)胞（b）siNSUN2轉(zhuǎn)染72h或吉非替尼（1µM）處理24h后，通過RNA-BS分析m5C平均水平。
c. m5C在對(duì)照組、NSUN2敲低組和吉非替尼處理組的H1650細(xì)胞不同區(qū)域分布。
d. H1650 siNSUN2#1細(xì)胞中m5C甲基化水平和mRNA表達(dá)水平發(fā)生顯著變化。
e. 維恩圖顯示了直接靶向NSUN2的潛在m5C修飾候選基因。
f-g. IGV分析顯示，NSUN2敲低或吉非替尼處理后，H1650 細(xì)胞(f)和PC-9細(xì)胞 (g)中QSOX1的mRNA表達(dá)和m5C水平發(fā)生變化。
h-j. 用抗m5C抗體免疫共沉淀純化mRNA, qRT-PCR分析H1650 (h)、H1975 (i)和HCC2279 (j)中QSOX1的m5C水平。
（6）NSUN2以m5C-YBX1依賴的方式調(diào)控QSOX1 mRNA翻譯
圖6：NSUN2和YBX1通過調(diào)控mRNA翻譯來調(diào)節(jié)QSOX1表達(dá)
b. 從H1650-shCtrl和H1650-shNSUN2異種移植物獲得的腫瘤QSOX1 IHC染色和定量H-scores評(píng)分代表性圖像。
c. 用siNSUN2預(yù)處理的H1650細(xì)胞用pcDNA-NSUN2-WT或pcDNA-NSUN2-Mut (C271A&C321A)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，western blot分析QSOX1表達(dá)。
d. 用200 nM嘌呤霉素處理siCtrl或siNSUN2轉(zhuǎn)染的H1650或H1975細(xì)胞，用相應(yīng)抗體western blot分析分析全細(xì)胞裂解物。
e. 將含有野生型或突變型(C-to-T/A突變) m5C位點(diǎn)的QSOX1 CDS克隆到熒光素酶報(bào)告載體中。
f. 分別轉(zhuǎn)染shCtrl和shNSUN2的H1650細(xì)胞中，野生型和突變型QSOX1 CDS報(bào)告載體的相對(duì)熒光素酶活性。
g. western blot分析siCtrl和siYBX1轉(zhuǎn)染的H1650和H1975細(xì)胞中QSOX1表達(dá)。
h. 以IgG為對(duì)照，用抗YBX1抗體在siCtrl或siNSUN2轉(zhuǎn)染的H1650細(xì)胞中進(jìn)行YBX1和QSOX1 mRNA免疫共沉淀。
i. 經(jīng)shYBX1預(yù)處理的H1650細(xì)胞用3FLAG-YBX1-WT或3FLAG-YBX1-Mut (W65A)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，western blot分析QSOX1表達(dá)。
j. 用200 nM嘌呤霉素處理siCtrl或siYBX1轉(zhuǎn)染的H1650或H1975細(xì)胞，用相應(yīng)抗體進(jìn)行western blot分析全細(xì)胞裂解物。
k. H1650細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染shCtrl和shYBX1后，野生型和突變型QSOX1 CDS報(bào)告載體的相對(duì)熒光素酶活性。l. 用siNSUN2或siYBX1單獨(dú)或聯(lián)合轉(zhuǎn)染H1650細(xì)胞72 h后，用相應(yīng)抗體western blot分析全細(xì)胞裂解物。
（7）QSOX1與吉非替尼固有耐藥性相關(guān)
圖7：QSOX1豐度調(diào)控NSCLC對(duì)吉非替尼的敏感性
a-b. 吉非替尼固有耐藥的NSCLC患者治療前后活檢QSOX1 IHC染色（a）和定量H-scores評(píng)分（b）代表性圖像。c. 用吉非替尼(1µM)或奧希替尼(1µM)處理敏感性和耐藥性細(xì)胞24 h, western blot分析QSOX1蛋白表達(dá)水平。
d. 用吉非替尼(1µM)處理經(jīng)靶向QSOX1（siQSOX1）或非靶向?qū)φ眨╯iCtrl）siRNA轉(zhuǎn)染的H1650和H1975細(xì)胞72 h，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。
e-f. 經(jīng)shNSUN2預(yù)處理的H1650細(xì)胞m5C位點(diǎn)用野生型QSOX1 (QSOX1-WT)或突變型QSOX1 (QSOX1-Mut)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，采用CCK-8 (e)或集落形成實(shí)驗(yàn)(f)檢測(cè)細(xì)胞增殖。
g-h. BALB/c裸鼠皮下移植H1975-shCtrl和H1975-shQSOX1細(xì)胞異種移植物的的腫瘤生長(zhǎng)曲線(g)和腫瘤重量(h) (每組n=7)。
i. TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集的Kaplan-Meier分析顯示NSUN2、YBX1和QSOX1聯(lián)合高表達(dá)預(yù)測(cè)較差的總生存率。采用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)確定P值(P=0.016)。
j. 非小細(xì)胞肺癌中異常m5C高甲基化通過NSUN2/YBX1/QSOX1軸導(dǎo)致吉非替尼固有耐藥性的工作模型。
結(jié)論
本研究表明，NSUN2-YBX1-QSOX1軸是調(diào)控NSCLC對(duì)EGFR-TKI固有耐藥性的重要機(jī)制。抑制NSUN2-YBX1-QSOX1軸可以通過m5C依賴性調(diào)節(jié)機(jī)制克服吉非替尼的固有耐藥性。研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了NSUN2-YBX1-QSOX1軸可以作為EGFR-TKI固有耐藥的NSCLC患者預(yù)后和治療的候選生物標(biāo)志物。
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