小檗堿通過介導m6A mRNA甲基化調(diào)控斑馬魚肝細胞氧化應(yīng)激
中藥小檗堿（Berberine，BBR，化學式C20H18NO4）是從幾種藥用植物中分離出的一種異喹啉季生物堿，包括小檗（Berberis aristata）和黃連（Coptis chinensis）。小檗堿可改善脂質(zhì)代謝紊亂誘導的細胞氧化應(yīng)激、凋亡和自噬，但其分子機制尚不清楚。
斑馬魚（Danio rerio，Cyprinidae）是發(fā)育、遺傳和繁殖的重要脊椎動物模式生物。肝臟是脂肪合成的主要器官，魚類體內(nèi)約90%的脂肪在肝臟中合成，肝臟在維持碳水化合物、氨基酸和脂肪酸的代謝平衡中發(fā)揮著重要作用。有許多研究使用斑馬魚肝細胞（Zebrafish hepatocyte，ZFL）來研究體外脂肪沉積。
2022年11月30日，上海交通大學徐維娜團隊在《Antioxidants》雜志發(fā)表題為“Berberine Regulation of Cellular Oxidative Stress, Apoptosis and Autophagy by Modulation of m6A mRNA Methylation through Targeting the Camk1db/ERK Pathway in Zebrafish-Hepatocytes”的研究論文，該研究以斑馬魚肝細胞（ZFL）作為代謝綜合征合并氧化應(yīng)激研究的模型系統(tǒng)，通過MeRIP-seq等實驗揭示了m6A RNA甲基化修飾在體外用小檗堿處理的ZFL脂質(zhì)沉積中的作用。
標題：Berberine Regulation of Cellular Oxidative Stress, Apoptosis and Autophagy by Modulation of m6A mRNA Methylation through Targeting the Camk1db/ERK Pathway in Zebrafish-Hepatocytes（小檗堿通過靶向斑馬魚肝細胞中的Camk1db/ERK通路介導m6A mRNA甲基化以調(diào)控細胞氧化應(yīng)激、凋亡和自噬）
時間：2022.11.30
期刊：Antioxidants
影響因子：IF 7.675
技術(shù)平臺：MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP -PCR、Western Blot等
研究摘要
為理解BBR改善脂質(zhì)代謝紊亂誘導的細胞氧化應(yīng)激、凋亡和自噬相關(guān)分子機制，本研究分析了m6A甲基化修飾在脂質(zhì)沉積斑馬魚肝細胞（ZFL）中的作用。結(jié)果表明，BBR促進肝細胞m6A RNA甲基化水平發(fā)生變化，增加Camk1db基因轉(zhuǎn)錄本的m6A水平并改變Camk1db基因的mRNA表達。通過敲除Camk1db基因，Camk1db可促進細胞ERK磷酸化水平。小檗堿通過改變Camk1db基因的m6A RNA甲基化來調(diào)控Camk1db mRNA表達水平，進而影響鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶合成和ERK信號通路激活，從而導致下游ROS產(chǎn)生、細胞增殖、凋亡和自噬等生理指標發(fā)生變化。本研究結(jié)果表明小檗堿可以通過靶向斑馬魚肝細胞中的Camk1db/ERK通路介導Camk1db m6A甲基化，從而調(diào)控細胞氧化應(yīng)激、凋亡和自噬。
研究結(jié)果
1、小檗堿對棕櫚酸鈉誘導的脂肪沉積斑馬魚肝細胞氧化應(yīng)激、凋亡和自噬的調(diào)控
圖1：ZFL內(nèi)不同處理組氧化應(yīng)激指標及ZFL透射電鏡圖。
（A） MDA（丙二醛）。（B） T-AOC（總抗氧化能力）。（C） ROS相對表達。（D） ROS熒光顯微鏡圖片。
圖2：小檗堿對棕櫚酸鈉誘導的肝細胞凋亡和自噬的影響。
（A） 流式細胞術(shù)檢測ZFL細胞凋亡，每組細胞計數(shù)為10000。（B） ZFL的凋亡和凋亡率。（C） P62蛋白和LC3-B蛋白的WB圖。（D） P62蛋白相對表達水平。（E） LC3-B蛋白相對表達水平。
2、小檗堿在棕櫚酸鈉誘導斑馬魚肝細胞m6A甲基化及轉(zhuǎn)錄水平中的作用
（1）m6A甲基化分析
從四個實驗組收集細胞：對照組（control）、脂質(zhì)沉積組（SP）、小檗堿組（BBR）和脂質(zhì)沉積+小檗堿組（SP+BBR），采用MeRIP-seq高通量測序進行甲基化分析，以研究小檗堿對脂質(zhì)沉積誘導斑馬魚細胞m6A甲基化的影響。如下表所示，在甲基化位點數(shù)上，小檗堿組檢測到的甲基化位點最多，其次是脂質(zhì)沉積+小檗堿組和對照組，脂質(zhì)沉積組檢測到的甲基化位點最少。結(jié)果表明，脂質(zhì)沉積和小檗堿的添加會影響斑馬魚肝細胞m6A甲基化位點數(shù)量。
為研究m6A位點在mRNA上的分布，根據(jù)m6A peaks在轉(zhuǎn)錄本上的分布將其分為四個區(qū)域：5'非翻譯區(qū)（5'UTR）、3'非翻譯區(qū)（3'UTR）、第一外顯子（1st Exon）和其他外顯子（Other Exon）。結(jié)果表明，大多數(shù)m6A peaks位于3'UTR區(qū)，其次是5'UTR區(qū)和Other Exon區(qū)。與對照組相比，脂質(zhì)沉積組3''UTR和5''UTR區(qū)m6A peaks顯著增加，而添加小檗堿后3'UTR區(qū)m6A peaks顯著降低，5'UTR區(qū)的m6A peaks進一步增加。m6A peaks具有較高的富集倍性，表明脂質(zhì)沉積誘導的斑馬魚肝細胞具有不同的m6A甲基化模式，且添加適量的小檗堿改變了這些m6A甲基化模式。
RNA的甲基化和去甲基化過程需要蛋白與甲基化位點motif的結(jié)合。對于四組樣品的motif預(yù)測，使用分析軟件HOMER用于在peaks區(qū)域中尋找高度可行性的motif。分析結(jié)果在四組中多次出現(xiàn)和高度相似的motif，揭示了斑馬魚甲基化位點的潛在motif。結(jié)果表明，4個不同處理組均含有“RRACH”motif，表明斑馬魚也符合其他物種的一般模式，證實了本實驗結(jié)果的可靠性，可用于后續(xù)分析。
（2）轉(zhuǎn)錄組分析
從四個實驗裝置組收集細胞用于轉(zhuǎn)錄組分析：對照（control），脂質(zhì)積累組（SP），小檗堿組（BBR）和脂質(zhì)積累+小檗堿組（SP+BBR）。
圖5：各組轉(zhuǎn)錄差異基因的KEGG富集分析。
（A） SP組與對照組比較。（B） BBR組與對照組比較。（C）SP+BBR組與對照組比較。（D） SP+BBR組與SP組比較。（E）BBR組與SP組比較。（F）SP+BBR組與BBR組比較。
（3）m6A甲基化組和轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析
對于轉(zhuǎn)錄水平和甲基化水平的相關(guān)性分析，分別分析了各組的甲基化水平和轉(zhuǎn)錄水平變化基因數(shù)量，以及各組同時在甲基化水平和轉(zhuǎn)錄水平存在顯著差異的基因數(shù)量，還對甲基化水平和轉(zhuǎn)錄水平的顯著差異基因進行KEGG通路富集分析（圖6）。
圖6：各組甲基化和轉(zhuǎn)錄水平差異顯著基因的KEGG富集分析。
（A） SP組與對照組比較。（B） BBR組與對照組比較。（C） SP+BBR組與對照組比較。（D） SP+BBR組與SP組比較。（E）BBR組與SP組比較。（F）SP+BBR組與BBR組比較。
（4）靶基因篩選
甲基化-轉(zhuǎn)錄水平關(guān)聯(lián)分析的篩選過程主要靶向甲基化水平顯著變化和轉(zhuǎn)錄水平顯著差異的基因（p<0.05）（Fc≥2）。從中篩選出斑馬魚的Camk1db基因作為下一步研究的候選基因。與對照組相比，脂質(zhì)沉積組Camk1db基因的m6A RNA甲基化水平顯著降低，轉(zhuǎn)錄水平降低但無顯著差異。小檗堿組的甲基化水平和轉(zhuǎn)錄水平顯著高于脂質(zhì)沉積組。與脂質(zhì)沉積組相比，脂質(zhì)沉積+小檗堿組的甲基化水平和轉(zhuǎn)錄水平也顯著增加。
3、Camk1db基因甲基化及其對ZFL細胞穩(wěn)態(tài)調(diào)控的驗證
結(jié)論：
本研究探討了小檗堿對棕櫚酸鈉誘導的ZFL細胞氧化應(yīng)激、凋亡和自噬等生物學功能的影響，同時確定了細胞RNA m6A甲基化的新方向，篩選出關(guān)鍵差異基因Camk1db。研究結(jié)果為魚類養(yǎng)殖業(yè)中保肝中草藥的研究與開發(fā)提供分子理論基礎(chǔ)。然而，仍然存在一些尚未解決的問題。有必要闡明m6A甲基化在體內(nèi)氧化應(yīng)激過程調(diào)控中的作用。
參考文獻：
Zhang M, Liu J, Yu C, Tang S, Jiang G, Zhang J, Zhang H, Xu J, Xu W. Berberine Regulation of Cellular Oxidative Stress, Apoptosis and Autophagy by Modulation of m6A mRNA Methylation through Targeting the Camk1db/ERK Pathway in Zebrafish-Hepatocytes. Antioxidants (Basel). 2022 Nov 30;11(12) pii: antiox11122370.
斑馬魚（Danio rerio，Cyprinidae）是發(fā)育、遺傳和繁殖的重要脊椎動物模式生物。肝臟是脂肪合成的主要器官，魚類體內(nèi)約90%的脂肪在肝臟中合成，肝臟在維持碳水化合物、氨基酸和脂肪酸的代謝平衡中發(fā)揮著重要作用。有許多研究使用斑馬魚肝細胞（Zebrafish hepatocyte，ZFL）來研究體外脂肪沉積。
2022年11月30日，上海交通大學徐維娜團隊在《Antioxidants》雜志發(fā)表題為“Berberine Regulation of Cellular Oxidative Stress, Apoptosis and Autophagy by Modulation of m6A mRNA Methylation through Targeting the Camk1db/ERK Pathway in Zebrafish-Hepatocytes”的研究論文，該研究以斑馬魚肝細胞（ZFL）作為代謝綜合征合并氧化應(yīng)激研究的模型系統(tǒng)，通過MeRIP-seq等實驗揭示了m6A RNA甲基化修飾在體外用小檗堿處理的ZFL脂質(zhì)沉積中的作用。
時間：2022.11.30
期刊：Antioxidants
影響因子：IF 7.675
技術(shù)平臺：MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP -PCR、Western Blot等
研究摘要
為理解BBR改善脂質(zhì)代謝紊亂誘導的細胞氧化應(yīng)激、凋亡和自噬相關(guān)分子機制，本研究分析了m6A甲基化修飾在脂質(zhì)沉積斑馬魚肝細胞（ZFL）中的作用。結(jié)果表明，BBR促進肝細胞m6A RNA甲基化水平發(fā)生變化，增加Camk1db基因轉(zhuǎn)錄本的m6A水平并改變Camk1db基因的mRNA表達。通過敲除Camk1db基因，Camk1db可促進細胞ERK磷酸化水平。小檗堿通過改變Camk1db基因的m6A RNA甲基化來調(diào)控Camk1db mRNA表達水平，進而影響鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶合成和ERK信號通路激活，從而導致下游ROS產(chǎn)生、細胞增殖、凋亡和自噬等生理指標發(fā)生變化。本研究結(jié)果表明小檗堿可以通過靶向斑馬魚肝細胞中的Camk1db/ERK通路介導Camk1db m6A甲基化，從而調(diào)控細胞氧化應(yīng)激、凋亡和自噬。
示意圖：小檗堿介導Camk1db/ERK1/2信號通路機制
1、小檗堿對棕櫚酸鈉誘導的脂肪沉積斑馬魚肝細胞氧化應(yīng)激、凋亡和自噬的調(diào)控
圖1：ZFL內(nèi)不同處理組氧化應(yīng)激指標及ZFL透射電鏡圖。
圖2：小檗堿對棕櫚酸鈉誘導的肝細胞凋亡和自噬的影響。2、小檗堿在棕櫚酸鈉誘導斑馬魚肝細胞m6A甲基化及轉(zhuǎn)錄水平中的作用
（1）m6A甲基化分析
從四個實驗組收集細胞：對照組（control）、脂質(zhì)沉積組（SP）、小檗堿組（BBR）和脂質(zhì)沉積+小檗堿組（SP+BBR），采用MeRIP-seq高通量測序進行甲基化分析，以研究小檗堿對脂質(zhì)沉積誘導斑馬魚細胞m6A甲基化的影響。如下表所示，在甲基化位點數(shù)上，小檗堿組檢測到的甲基化位點最多，其次是脂質(zhì)沉積+小檗堿組和對照組，脂質(zhì)沉積組檢測到的甲基化位點最少。結(jié)果表明，脂質(zhì)沉積和小檗堿的添加會影響斑馬魚肝細胞m6A甲基化位點數(shù)量。
表1：4個實驗組的甲基化位點數(shù)量比較
為研究m6A位點在mRNA上的分布，根據(jù)m6A peaks在轉(zhuǎn)錄本上的分布將其分為四個區(qū)域：5'非翻譯區(qū)（5'UTR）、3'非翻譯區(qū)（3'UTR）、第一外顯子（1st Exon）和其他外顯子（Other Exon）。結(jié)果表明，大多數(shù)m6A peaks位于3'UTR區(qū)，其次是5'UTR區(qū)和Other Exon區(qū)。與對照組相比，脂質(zhì)沉積組3''UTR和5''UTR區(qū)m6A peaks顯著增加，而添加小檗堿后3'UTR區(qū)m6A peaks顯著降低，5'UTR區(qū)的m6A peaks進一步增加。m6A peaks具有較高的富集倍性，表明脂質(zhì)沉積誘導的斑馬魚肝細胞具有不同的m6A甲基化模式，且添加適量的小檗堿改變了這些m6A甲基化模式。
圖3：ZFL中各組m6A peaks分布
RNA的甲基化和去甲基化過程需要蛋白與甲基化位點motif的結(jié)合。對于四組樣品的motif預(yù)測，使用分析軟件HOMER用于在peaks區(qū)域中尋找高度可行性的motif。分析結(jié)果在四組中多次出現(xiàn)和高度相似的motif，揭示了斑馬魚甲基化位點的潛在motif。結(jié)果表明，4個不同處理組均含有“RRACH”motif，表明斑馬魚也符合其他物種的一般模式，證實了本實驗結(jié)果的可靠性，可用于后續(xù)分析。
圖4：m6A甲基化分析。
（A） ZFL中不同處理組的前十個motif分析。（B） 每組前六位motif分析*-可能為假陽性。（2）轉(zhuǎn)錄組分析
從四個實驗裝置組收集細胞用于轉(zhuǎn)錄組分析：對照（control），脂質(zhì)積累組（SP），小檗堿組（BBR）和脂質(zhì)積累+小檗堿組（SP+BBR）。
圖5：各組轉(zhuǎn)錄差異基因的KEGG富集分析。
（3）m6A甲基化組和轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析
對于轉(zhuǎn)錄水平和甲基化水平的相關(guān)性分析，分別分析了各組的甲基化水平和轉(zhuǎn)錄水平變化基因數(shù)量，以及各組同時在甲基化水平和轉(zhuǎn)錄水平存在顯著差異的基因數(shù)量，還對甲基化水平和轉(zhuǎn)錄水平的顯著差異基因進行KEGG通路富集分析（圖6）。
圖6：各組甲基化和轉(zhuǎn)錄水平差異顯著基因的KEGG富集分析。
（4）靶基因篩選
甲基化-轉(zhuǎn)錄水平關(guān)聯(lián)分析的篩選過程主要靶向甲基化水平顯著變化和轉(zhuǎn)錄水平顯著差異的基因（p<0.05）（Fc≥2）。從中篩選出斑馬魚的Camk1db基因作為下一步研究的候選基因。與對照組相比，脂質(zhì)沉積組Camk1db基因的m6A RNA甲基化水平顯著降低，轉(zhuǎn)錄水平降低但無顯著差異。小檗堿組的甲基化水平和轉(zhuǎn)錄水平顯著高于脂質(zhì)沉積組。與脂質(zhì)沉積組相比，脂質(zhì)沉積+小檗堿組的甲基化水平和轉(zhuǎn)錄水平也顯著增加。
3、Camk1db基因甲基化及其對ZFL細胞穩(wěn)態(tài)調(diào)控的驗證
圖7：驗證Camk1db基因甲基化及其對ZFL細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用。
（A）ZFL中Camk1db基因的m6A甲基化水平。（B）Camk1db基因在ZFL中的相對mRNA表達。（C）肝細胞活性。（D）細胞內(nèi)ROS相對表達。（E）細胞凋亡率。（F）LC3-B和P62蛋白的WB圖。（G）P62蛋白的相對含量。（H）LC3-B蛋白的相對含量。（I，J）P-ERK/ERK蛋白轉(zhuǎn)染前后的WB圖和相對水平。（K，L）不同處理組（對照組、SP組、BBR組、SP+BBR組）P-ERK/ERK蛋白的WB 圖和相關(guān)蛋白表達。結(jié)論：
本研究探討了小檗堿對棕櫚酸鈉誘導的ZFL細胞氧化應(yīng)激、凋亡和自噬等生物學功能的影響，同時確定了細胞RNA m6A甲基化的新方向，篩選出關(guān)鍵差異基因Camk1db。研究結(jié)果為魚類養(yǎng)殖業(yè)中保肝中草藥的研究與開發(fā)提供分子理論基礎(chǔ)。然而，仍然存在一些尚未解決的問題。有必要闡明m6A甲基化在體內(nèi)氧化應(yīng)激過程調(diào)控中的作用。
參考文獻：
Zhang M, Liu J, Yu C, Tang S, Jiang G, Zhang J, Zhang H, Xu J, Xu W. Berberine Regulation of Cellular Oxidative Stress, Apoptosis and Autophagy by Modulation of m6A mRNA Methylation through Targeting the Camk1db/ERK Pathway in Zebrafish-Hepatocytes. Antioxidants (Basel). 2022 Nov 30;11(12) pii: antiox11122370.
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