3T3-L細(xì)胞誘導(dǎo)分化操作步驟

3T3-L1 (小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)是從3T3細(xì)胞（Swissalbino）中經(jīng)克隆分離得到的連續(xù)傳代的亞系。該細(xì)胞從快速分裂到匯合和接觸性抑制狀態(tài)經(jīng)歷了前脂肪細(xì)胞到脂肪樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。該細(xì)胞鼠痘病毒陰性；可產(chǎn)生甘油三酯，高濃度血清可增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積�？捎糜谘芯刻悄虿。�肥胖癥等。
細(xì)胞名稱：小鼠胚胎成纖維(經(jīng)成脂分化驗(yàn)證)
細(xì)胞簡稱：3T3-L1
產(chǎn)品貨號：TCM-C702
種屬來源：小鼠
組織來源：胚胎
細(xì)胞形態(tài)：成纖維細(xì)胞樣
生長特性：貼壁生長
培養(yǎng)體系：DMEM-H+10%CS（新生牛血清）+1%P/S
配套培養(yǎng)基貨號：TCM-G702
傳代比例：1:3-1:4，每2-3天換液一次
傳代周期：48-72 h
培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%CO₂，溫度：37℃
凍存條件：60%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+30%FBS+10%DMSO，液氮儲存推薦海星Hycyte® 一步凍存液（即用型、無血清、無需程序降溫）

 3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)注意事項

細(xì)胞密度：細(xì)胞密度是影響3T3-L1細(xì)胞分化的重要因素，過低或過高的細(xì)胞密度都會影響分化效果；密度一般控制在90%的匯合度，如果太低，則會影響細(xì)胞生長和分化，如果太高，則會導(dǎo)致細(xì)胞死亡和分化受阻。

培養(yǎng)基：3T3-L1細(xì)胞最適宜的培養(yǎng)基是DMEM高糖+10%新生牛血清。
傳代：3T3-L1細(xì)胞的傳代次數(shù)應(yīng)該控制在10次以內(nèi)，否則會影響細(xì)胞的生長和分化。在進(jìn)行傳代時，需要注意細(xì)胞的消化過程，細(xì)胞對胰酶比較敏感，添加胰酶后約1分鐘內(nèi)細(xì)胞會脫落，因此消化時間的把控極其重要，同時避免過度打碎細(xì)胞團(tuán)，以保證細(xì)胞的生長和分化能力。

3T3-L1細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化操作步驟

前脂肪細(xì)胞是一類同時具有增殖和分化為成熟脂肪細(xì)胞能力的前體細(xì)胞，此種前體細(xì)胞在不同的生長因子、激素等物質(zhì)的作用下，經(jīng)歷有絲分裂克隆期、生長停滯期、進(jìn)一步的克隆期、終末分化四個階段，細(xì)胞本身的成纖維狀態(tài)發(fā)生改變，通過胞質(zhì)內(nèi)甘油三脂聚集形成成熟脂肪細(xì)胞。誘導(dǎo)完成后，經(jīng)油紅O染色，就可以在鏡下觀察到甘油三脂脂肪滴的生成。

1.成脂誘導(dǎo)分化操作

1.1 接種干細(xì)胞取對數(shù)生長期3T3-L1的細(xì)胞，按照2.0×10^4cells/c㎡的細(xì)胞密度接種至培養(yǎng)器皿，于37℃，5%CO₂培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)至匯合度90%，棄掉上清，加入成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)液。

NOTE：如細(xì)胞貼壁性較差，建議使用 0.1%明膠對培養(yǎng)底 面進(jìn)行包被。

1.2 細(xì)胞分化誘導(dǎo)于37℃，5%CO₂培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)約3天，更換為成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基維持液，培養(yǎng)1天后， 再更換為成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)液，繼續(xù)培養(yǎng)3天。
 按照以上換液頻率誘導(dǎo)14~21天，并注意觀 察細(xì)胞形態(tài)變化。根據(jù)細(xì)胞誘導(dǎo)形成的脂滴數(shù)量 和大小，決定終止細(xì)胞誘導(dǎo)的時間，并進(jìn)行染色 鑒定。
2.染色鑒定
2.1 細(xì)胞固定吸去培養(yǎng)基使用適量1×PBS清洗一次，棄去后取適量4%中性甲醛溶液覆蓋培養(yǎng)器皿底面，室 溫固定 30~60 min，棄去固定液再使用1×PBS清洗兩次。
2.2 油紅O染色取生理鹽水或1×PBS與油紅O原液配制油紅O工作液（油紅O原液: 生理鹽水=3:2），現(xiàn)用現(xiàn) 配。配制后可對油紅O工作液進(jìn)行離心，以沉淀 染色液中的過飽和析出物。向清洗干凈的誘導(dǎo)孔內(nèi)加入適量油紅O工作液，靜置染色30min。吸走油紅O工作液，用1×PBS清洗兩次，并加入適量1×PBS避免細(xì)胞干燥。
2.3誘導(dǎo)評估顯微鏡下觀察成脂染色效果，并進(jìn)行圖像采集和誘導(dǎo)評估。誘導(dǎo)成功時，脂滴與油紅O染料 結(jié)合后呈現(xiàn)紅色或橘紅色。

NOTE: 成脂分化水平因細(xì)胞類型、培養(yǎng)條件、細(xì)胞代次、細(xì)胞狀態(tài)和分化時間等因素而異。