用于生物偶聯(lián)和熒光成像的雙束縛兩性離子NIR-I和NIR-II七甲基菁染料

本文要點(diǎn)：七甲基菁染料可在近紅外(NIR)窗口進(jìn)行深層組織熒光成像�；鶞�(zhǔn)染料ZW800-1的小分子偶聯(lián)物已經(jīng)在人體上進(jìn)行了測(cè)試。然而，由于結(jié)構(gòu)中化學(xué)不穩(wěn)定的C4’-O-芳基連接物容易被生物親核試劑切割，ZW800-1偶聯(lián)物的長(zhǎng)期成像方案的開(kāi)發(fā)受到限制。本文報(bào)告了一種模塊化的合成方法，合成了新型的雙束縛兩性離子七甲基菁染料，染料為ZW800-1的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，但穩(wěn)定性大大提高。這種雙束縛染料的NIR-I和NIR-II版本可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，如單克隆抗體，而不會(huì)導(dǎo)致熒光團(tuán)降解或染料堆積在蛋白質(zhì)表面。該熒光抗體結(jié)合物在異種小鼠腫瘤模型中顯示出良好的腫瘤靶向性。雙束縛分子設(shè)計(jì)提供的增強(qiáng)的穩(wěn)定性將使新的活體近紅外熒光成像實(shí)驗(yàn)成為可能，并可能移植到人類(lèi)身上。

 

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在NIR-I(700-1000 nm)或NIR-II(10001700 nm)窗口中具有吸收和發(fā)射波長(zhǎng)的熒光團(tuán)的在生物醫(yī)學(xué)成像方面具有很大的應(yīng)用潛力，因?yàn)榻�紅外光對(duì)皮膚和組織有相對(duì)較深的穿透能力。幾十年來(lái)，吸收/發(fā)射波長(zhǎng)約為800 nm的臨床近紅外七甲川菁染料吲哚青綠(ICG)一直被用于光學(xué)成像和診斷(方案1)。雖然ICG被廣泛應(yīng)用，但它的最終潛力是有限的，因?yàn)槠洳荒芘c靶向生物分子結(jié)合。一種商用NIR-I染料IRdye800CW，分子中含有羧基和多個(gè)磺酸鹽，使其可以生物偶聯(lián)且具有良好的水溶性。許多生物偶聯(lián)物已經(jīng)被制備并用于體內(nèi)成像性能的評(píng)估。在某些情況下，非目標(biāo)器官組織中不希望的染料或熒光生物結(jié)合物積累被觀察到，這促進(jìn)了兩性離子染料的發(fā)展，因?yàn)槠淇梢詼p少染料與生物表面的結(jié)合。一個(gè)典型的例子是ZW800-1，它已經(jīng)用于不同類(lèi)型的生物偶聯(lián)十多年。其染料本身或小分子結(jié)合物是非常親水的，通過(guò)腎臟從血液中迅速清除。ZW800-1與靶向癌癥組織的環(huán)-RGD肽基序的偶聯(lián)物，已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。也有越來(lái)越多的報(bào)告使用ZW800-1或結(jié)構(gòu)類(lèi)似物標(biāo)記用于活體成像和組織學(xué)應(yīng)用的大分子，或生物材料，如細(xì)胞表面、水凝膠、納米顆粒、3D打印生物復(fù)合材料或用于組織工程應(yīng)用的細(xì)胞外基質(zhì)生物聚合物。對(duì)于這些大多數(shù)的應(yīng)用來(lái)說(shuō)，一個(gè)必要的染料性能特性是熒光生物偶聯(lián)物的長(zhǎng)期化學(xué)穩(wěn)定性，這一要求突出了ZW800-1潛在的化學(xué)反應(yīng)問(wèn)題；即，由于生物親核試劑對(duì)染料的4‘-苯氧基進(jìn)行親核取代而導(dǎo)致的連接基團(tuán)斷裂(如方案1中的粉色箭頭所示)。將ZW800-1標(biāo)記的抗體或納米顆粒樣品在血清中孵育24小時(shí)的研究已經(jīng)觀察到熒光信號(hào)的大量損失。在近生理?xiàng)l件下，各種生物親核試劑對(duì)染料的分子內(nèi)和分子間攻擊的可能性很大。由于染料降解造成的熒光信號(hào)的損失為縱向?qū)嶒?yàn)帶來(lái)了不確定性（縱向?qū)嶒?yàn)旨在測(cè)量已標(biāo)記有染料的植入生物材料的長(zhǎng)期降解或運(yùn)輸）。

 

如方案1的頂部所示，本文開(kāi)發(fā)了一種NIR-I菁染料的合成方法，這類(lèi)染料由兩個(gè)或四個(gè)側(cè)翼線性臂立體地屏蔽在平面染料的每個(gè)表面上。方案1顯示了本文的重點(diǎn)：即一類(lèi)性能大大增強(qiáng)的新型雙束縛和可偶聯(lián)的NIR-I和NIR-II七甲基菁染料。有關(guān)雙束縛染料的文獻(xiàn)包括幾個(gè)有機(jī)可溶的例子和一個(gè)水溶性分子。但這些染料大多數(shù)都不在近紅外區(qū)域發(fā)射，也沒(méi)有一種是為水中的生物偶聯(lián)而設(shè)計(jì)的。本文通過(guò)制造穩(wěn)定的雙束縛的ZW800-1解決了其的降解問(wèn)題，稱(chēng)之為dsZW800-1。此外，通用的合成方法提供了雙束縛的NIR-II熒光染料dsZW1015，其吸收/發(fā)射最大值>1000 nm，生成了dsZW1015標(biāo)記的抗體結(jié)合物，并成功地用于對(duì)小鼠腫瘤進(jìn)行體內(nèi)NIR-II熒光成像。

方案1

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1.dsZW800-1的合成

dsZW800-1的合成如方案2所示。合成的關(guān)鍵中間體是未束縛染料3，它是在溫和的條件下用苯酚2取代前體1中的4‘-氯原子組裝而成的，其中2的結(jié)構(gòu)上帶有兩個(gè)含有末端疊氮基的附加臂。隨后通過(guò)皂化反應(yīng)將3轉(zhuǎn)化為無(wú)束縛染料4，然后在銅的催化下發(fā)生疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)共價(jià)連接兩條側(cè)翼帶，以62%的產(chǎn)率合成了dsZW800-1。

方案2

 

2.dsZW800-1的分子結(jié)構(gòu)

用標(biāo)準(zhǔn)波譜方法對(duì)所有化合物的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。ZW800-1和未束縛染料4的化學(xué)位移非常匹配，表明二者分子構(gòu)象相似。相比之下，dsZW800-1的光譜包括多次甲基質(zhì)子的特定高場(chǎng)化學(xué)位移，指示兩條側(cè)翼帶中的三唑環(huán)的空間磁屏蔽。dsZW800-1的X射線晶體結(jié)構(gòu)也證實(shí)了這種分子內(nèi)屏蔽效應(yīng)(圖1)。通過(guò)與文獻(xiàn)報(bào)道的具有4‘-苯氧基取代基的七甲基菁的晶體結(jié)構(gòu)的比較，揭示了dsZW800-1中兩條側(cè)鏈引起的兩個(gè)獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征。一個(gè)特征是4‘-苯氧基環(huán)相對(duì)于七甲基菁熒光團(tuán)的取向。通常情況下，4‘-苯氧基環(huán)的縱軸遠(yuǎn)離七甲基菁的垂直面，但在dsZW8001中，4’-苯氧基環(huán)被側(cè)翼帶強(qiáng)迫與垂直的七甲基菁環(huán)對(duì)齊，并將其面朝染料的一端旋轉(zhuǎn)。另一個(gè)獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征是分子內(nèi)晶格堆積距離。通常情況下，七甲川菁染料表現(xiàn)出聚次甲基熒光團(tuán)的滑動(dòng)同面堆積，典型的分子間距離約為3.5-5.0 Å。但dsZW800-1的側(cè)翼?xiàng)l帶增加了每個(gè)分子的空間隔離，相鄰熒光染料之間的分子間固態(tài)距離為~9 Å。因此，即使dsZW800-1的多個(gè)拷貝在自聚集條件下被迫聚集在一起，側(cè)翼?xiàng)l帶也確保了足夠的空間分離，以防止染料轉(zhuǎn)移偶極的強(qiáng)烈耦合。

圖1

 

3.dsZW800-1的光譜性質(zhì)和穩(wěn)定性

表1中染料光物理性質(zhì)的比較表明，與ZW8001相比，dsZW800-1中的兩條側(cè)翼帶并沒(méi)有顯著改變最大吸收和發(fā)射波長(zhǎng)或熒光峰寬度。有趣的是，dsZW800-1在PBS中的熒光量子產(chǎn)率(11.0%)明顯高于形式上為結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的未束縛熒光團(tuán)4的熒光量子產(chǎn)率(8.1%)。這一差異表明，dsZW800-1中的約束側(cè)翼帶更有效地抑制了從染料激發(fā)態(tài)到周?chē)�水化殼層的非輻射能量轉(zhuǎn)移，這通常是高共軛近紅外染料在水中的主要能量弛豫途徑。

 

接著進(jìn)行光漂白實(shí)驗(yàn)量化ZW800-1、4和dsZW800-1的光穩(wěn)定性，即使用帶有620 nm長(zhǎng)通濾光片的氙燈照射PBS中的不同染料溶液，并將漂白曲線擬合為單相指數(shù)衰減(圖2)。光穩(wěn)定性的測(cè)定順序?yàn)?strong>4>dsZW800-1>ZW800-1。七甲基菁染料的主要光漂白途徑是光生單線態(tài)氧與多次甲基熒光團(tuán)的雙分子反應(yīng)，其次是鍵的斷裂和非熒光羰基片段的形成。ZW800-1的相對(duì)較差的光穩(wěn)定性與親電單重態(tài)氧和具有給電子體4‘苯氧基取代基的七甲基菁化合物的高反應(yīng)性一致。4和dsZW800-1的相對(duì)增強(qiáng)的光穩(wěn)定性歸因于近端線性臂或帶提供的空間位阻屏蔽效應(yīng)，這可能降低氧的光敏化效率和/或抑制隨后與單重態(tài)氧的雙分子反應(yīng)。

表1

 

圖2

 

繼續(xù)評(píng)價(jià)每種染料的化學(xué)穩(wěn)定性，將染料與1 mM谷胱甘肽(GSH)混合的溶液在pH 7.4的PBS緩沖液中孵育后，進(jìn)行一系列光譜實(shí)驗(yàn)。GSH中的親核性的硫醇取代七甲基菁的對(duì)苯氧基很容易跟蹤，因?yàn)樵摲磻?yīng)在七甲基菁的吸光度中產(chǎn)生了明顯的紅移。圖3a顯示的是GSH與ZW800-1反應(yīng)的化學(xué)產(chǎn)物。圖3b中的曲線圖比較了這三種染料在含有1 mM GSH的pH 7.4的PBS緩沖液中的穩(wěn)定性。未束縛的染料ZW800-1和4的半衰期(t1/2)分別為7.1分鐘和27分鐘。相比之下，dsZW800-1與1 mM GSH孵育10小時(shí)后，吸收光譜沒(méi)有變化，表明沒(méi)有發(fā)生化學(xué)反應(yīng)(由質(zhì)譜儀證實(shí))。由于某些細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽水平可以達(dá)到10 mM，將dsZW800-1樣品與10 mM GSH孵育10小時(shí)，仍然沒(méi)有證據(jù)表明dsZW800-1有任何降解。這種對(duì)GSH攻擊的保護(hù)有效地證明了dsZW800-1中的兩條側(cè)翼帶可以有效地完全阻止生物親核試劑取代不穩(wěn)定的七甲基菁4‘苯氧基。

圖3

 

4. 利用dsZW800-1進(jìn)行抗體標(biāo)記

谷胱甘肽引起的染料降解實(shí)驗(yàn)表明，未捆綁的ZW800-1和4應(yīng)當(dāng)不是蛋白質(zhì)標(biāo)記的良好選擇，因?yàn)殡S著時(shí)間的推移，不穩(wěn)定的七甲川菁4‘苯氧基會(huì)被蛋白質(zhì)表面的親核側(cè)鏈切割，例如蛋白表面賴(lài)氨酸殘基的ε-氨基。評(píng)估ZW8001和dsZW800-1用于蛋白質(zhì)結(jié)合的適宜性的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一推斷。使用標(biāo)準(zhǔn)的酰胺鍵形成的化學(xué)方法將ZW800-1或dsZW800-1連接到山羊IgG抗體或牛血清白蛋白(BSA)上。結(jié)果顯示，與dsZW800-1結(jié)合的蛋白質(zhì)比與ZW800-1結(jié)合的蛋白質(zhì)產(chǎn)生更高的標(biāo)記度(DOL)，并且dsZW800-1標(biāo)記的蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度高3-4倍。著眼于免疫球蛋白偶聯(lián)物的穩(wěn)定性，觀察到IgG-dsZW800-1的NIR信號(hào)比IgG-ZW800-1穩(wěn)定得多。已知的IgG-ZW800-1的化學(xué)降解是一個(gè)重大的技術(shù)限制，而IgG-dsZW800-1的穩(wěn)定性大大增強(qiáng)。dsZW800-1有望作為一種穩(wěn)定的近紅外熒光標(biāo)簽，用來(lái)進(jìn)行測(cè)量染料標(biāo)記細(xì)胞或生物材料的降解或運(yùn)輸?shù)目v向?qū)嶒?yàn)。

 

5. 使用dsZW800-1進(jìn)行活體成像

通過(guò)將dsZW800-1結(jié)合到Panitumab(Pan,一種針對(duì)EGFR陽(yáng)性腫瘤的臨床單抗)上，評(píng)估dsZW800-1標(biāo)記抗體的體內(nèi)成像性能。圖4a中Pan-dsZW800-1(DOL=3.1)的吸收光譜在772 nm處有一個(gè)相對(duì)較窄的峰，其激發(fā)產(chǎn)生的熒光光譜與游離染料相同。沒(méi)有顯示出與dsZW800-1染料在抗體表面的H堆積所對(duì)應(yīng)的吸收峰藍(lán)移，而染料的H堆積猝滅會(huì)染料的熒光，并可能改變抗體的生物分布。此外，Pan-dsZW800-1在4oC環(huán)境下15天的吸收光譜沒(méi)有變化，這表明它與臨床上使用的重組Pan具有非常相似的儲(chǔ)存壽命。通過(guò)靜脈注射Pan-dsZW800-1在EGFR+JIMT-1(三陰性乳腺癌)荷瘤小鼠身上測(cè)試體內(nèi)成像性能。使用商業(yè)活體成像站(IVIS)和NIR-I熒光成像設(shè)置觀察到特異性和高攝取率，平均腫瘤與背景比(TBR)在注射后72小時(shí)約為8，肝臟信號(hào)可以忽略(圖4b，4c)。注射后72小時(shí)處死小鼠，器官的NIR-I熒光成像證實(shí)了Pan-dsZW800-1具有很高的腫瘤特異性(圖4d、4e)。

圖4

 

6. dsZW1015的合成

繼續(xù)將雙束縛七甲基菁改造為光譜范圍擴(kuò)大到在NIR-II區(qū)(1000-1700 nm)吸收和發(fā)射的熒光染料，以改善活體成像。最近商用InGaAs相機(jī)的出現(xiàn)極大地促進(jìn)了NIR-II成像的研究，但目前限制進(jìn)一步發(fā)展的一個(gè)因素是缺乏相對(duì)較小(MW<2000 Da)的親水性和兩性離子NIR-II染料，這些染料可以附著在靶向生物分子上，如抗體或粘附體，而不形成非熒光染料的H-堆積或改變靶向生物大分子的特異性。NIR-II染料廣泛的疏水表面積使得生產(chǎn)用于靶向生物成像的水溶性生物結(jié)合物非常具有挑戰(zhàn)性。一種著名的NIR-II花青染料FD-1080(方案1)，其結(jié)構(gòu)包括疏水的苯并[c，d]吲哚雜環(huán)作為末端單元。在PBS溶液中，F(xiàn)D-1080(及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物)形成非熒光H-聚集體，因此必須將其配置成與血清蛋白的非共價(jià)絡(luò)合物，或者包裝在自組裝膠束或脂質(zhì)體中用于體內(nèi)成像研究。FD-1080的第二個(gè)功能缺陷是缺乏合適的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。為了解決這兩個(gè)問(wèn)題，采用了方案3中所示的模塊化合成序列來(lái)制備雙束縛帶、帶電平衡的NIR-II染料dsZW1015。關(guān)鍵的合成前體是七甲基菁5，它是以商品化試劑苯并[c，d]吲哚-2(1H)-酮為起始的四步法制備的。隨后的兩個(gè)步驟引入了可共軛的羧基，并產(chǎn)生了未束縛的七甲川菁7，它被轉(zhuǎn)化為所需的雙束縛形式dsZW1015。值得注意的是，方案3中列出的所有化合物的非平面結(jié)構(gòu)極大地促進(jìn)了柱層析的純化。

方案3

 

7. dsZW1015的光譜性質(zhì)

NIR-II染料本身具有較低的熒光量子產(chǎn)率，dsZW1015在DMSO中的測(cè)量值為0.10%，未束縛的異構(gòu)體7的熒光量子產(chǎn)率為0.11%，與文獻(xiàn)報(bào)道的非極性有機(jī)溶劑中的NIR-II染料相當(dāng)。在水中，NIR-II熒光量子產(chǎn)率更低，但dsZW1015-1在PBS中的熒光量子產(chǎn)率(0.014%)是7的熒光量子產(chǎn)率(0.006%)的兩倍多。亮度的增加可能有兩個(gè)原因。一個(gè)是NIR-II熒光團(tuán)對(duì)周?chē)�水合球體的空間屏蔽增強(qiáng)(類(lèi)似于上面的ZW800-1和4的比較)，第二個(gè)是染料自聚集方面的顯著差異。吸收光譜表明，在PBS中，未束縛的7在~850 nm處顯示出第二個(gè)藍(lán)移的非熒光的H聚集吸收帶，而雙束縛的dsZW1015僅在980 nm處以發(fā)射單體的形式存在。

 

8.使用dsZW1015進(jìn)行活體成像

以dsZW1015的NHS酯為原料，制備DOL=1.2的Pan-dsZW1015結(jié)合物。Pan-dsZW1015的吸收光譜只在1000 nm處顯示一個(gè)發(fā)光單體染料峰(圖5a)，沒(méi)有證據(jù)表明多個(gè)染料的H堆積，在4 oC下15天后光譜性質(zhì)也沒(méi)有變化。dsZW1015應(yīng)該目前是第一個(gè)與生物大分子偶聯(lián)的兩性離子七甲川菁NIR-II染料。在JIMT-1小鼠腫瘤模型上評(píng)估pan-dsZW1015的成像性能�；铙w全身NIR-II熒光圖像顯示，由于附加的疏水性苯并[c，d]吲哚類(lèi)染料的影響，初始肝臟信號(hào)很強(qiáng)(4小時(shí)和24小時(shí))。盡管如此，在注射后72小時(shí)觀察到明顯的腫瘤靶向，并且偏離目標(biāo)的信號(hào)非常低(圖5b和5c)。成像結(jié)果表明，dsZW1015是具有空間屏蔽和平衡電荷的良好結(jié)構(gòu)組合，能夠產(chǎn)生具有特定靶向特性的標(biāo)記抗體，用于活體對(duì)象的有效近紅外成像。

圖5

 

結(jié)論：

綜上所述，本文驗(yàn)證了雙束縛七甲川菁染料是一類(lèi)新的高性能、可偶聯(lián)的近紅外熒光團(tuán)。與基準(zhǔn)NIR-I染料ZW8001相比，雙束縛類(lèi)似物染料dsZW800-1顯示出略高的熒光亮度，更好的化學(xué)穩(wěn)定性和兩倍的光穩(wěn)定性。在使用染料標(biāo)記抗體的熒光成像方面，dsZW800-1優(yōu)于ZW800-1，并且將更適合于測(cè)量植入染料標(biāo)記生物材料的長(zhǎng)期降解或運(yùn)輸?shù)目v向?qū)嶒?yàn)。值得注意的是，使用與ZW800-1密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)的NIR-I七甲川菁染料的熒光探針越來(lái)越多，由于存在活性4‘-苯氧基，每個(gè)熒光探針都可能有穩(wěn)定性限制。在這種情況下，都應(yīng)該直接制備這些NIR-I染料的雙束縛形式，以期改善穩(wěn)定性和成像性能。模塊化合成方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是末端雜環(huán)可以直接變化，如制備末端帶有苯并[c，d]吲哚雜環(huán)的雙束縛七甲基菁染料dsZW1015，該末端苯并[c，d]吲哚雜環(huán)將吸收/發(fā)射波長(zhǎng)擴(kuò)展到NIR-II區(qū)域�？臻g屏蔽和平衡電荷的結(jié)構(gòu)組合抵消了dsZW1015中熒光團(tuán)帶來(lái)的疏水性增強(qiáng)，可以生成染料標(biāo)記的抗體，用于活體小鼠腫瘤的有效NIR-II熒光成像。未來(lái)的設(shè)計(jì)迭代可以在末端雜環(huán)中加入合適的官能團(tuán)，以生產(chǎn)這些雙束縛花青染料的生物響應(yīng)型版本，用于下一代“turn-on”或“ratiometric”近紅外熒光探針的應(yīng)用拓展。

 

參考文獻(xiàn)

Li, D. H.; Gamage, R. S.; Oliver, A. G.; Patel, N. L.; Muhammad Usama, S.; Kalen, J. D.; Schnermann, M. J.; Smith, B. D., Doubly Strapped Zwitterionic NIR-I and NIR-II Heptamethine Cyanine Dyes for Bioconjugation and Fluorescence Imaging. Angew Chem Int Ed Engl 2023, e202305062.

 

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