雙特異性納米抗體研究進(jìn)展

1. 什么是雙特異性納米抗體

雙特異性抗體（Bispecificantibody，BsAb）是1960年Nisonoff 團(tuán)隊(duì)首次提出，是一種可以同時(shí)結(jié)合兩種特異性表位或目的物的人工工程化抗體。2009年首個(gè)BsAb藥物Catumaxomab被歐盟批準(zhǔn)上市，給腫瘤治療帶來了新的希望。
雙特異性納米抗體是指利用基因工程技術(shù)對(duì)納米抗體進(jìn)行人工改造，形成新的雙特異性納米抗體分子，并保持其優(yōu)異的性能，從而在抗體工程應(yīng)用領(lǐng)域具有良好的前景。

圖1：雙特異性納米抗體

2. 納米抗體及優(yōu)點(diǎn)

羊駝是駱駝科的成員，包括美洲駝（Llama）以及我們熟悉的羊駝（Alpaca）。除常規(guī)IgG外，駝科動(dòng)物還產(chǎn)生一種功能性單鏈抗體，該抗體能夠與抗原結(jié)合，即為納米抗體，有時(shí)稱為VHH抗體。納米抗體（Nanobody, Nb 晶體為2.5nm，長(zhǎng)4nm，分子量只有15KDa。這些抗體僅由重鏈組成，缺乏輕鏈和功能性CH1和CH4結(jié)構(gòu)域。這些所謂的重鏈抗體正被用于開發(fā)單域抗體。這些抗體的單結(jié)構(gòu)域性質(zhì)提供了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，使其在生物技術(shù)應(yīng)用中脫穎而出。

納米抗體的優(yōu)點(diǎn)：

（1）在高溫和pH下的穩(wěn)定性；
（2）VHH可以識(shí)別通常不被常規(guī)抗體識(shí)別的抗原位點(diǎn)；
（3）它們的小分子片段有助于快速組織滲透和標(biāo)記應(yīng)用，包括跨越血腦屏障；
（4）用于大規(guī)模生產(chǎn)節(jié)約成本的替代品。

3. 納米抗體的制備

相比較傳統(tǒng)的單克隆抗體，納米抗體的制備具有很大優(yōu)勢(shì)。可以概括為免疫羊駝獲得抗體基因和噬菌體展示來獲得目的抗體序列。主要分為羊駝免疫，噬菌體文庫(kù)構(gòu)建，篩選抗體庫(kù)、抗體表達(dá)與功能驗(yàn)證四個(gè)步驟。

3.1羊駝免疫

挑選適齡羊駝→準(zhǔn)備抗原→免疫羊駝→采血測(cè)定效價(jià)→PBMC細(xì)胞分離

3.2 噬菌體文庫(kù)構(gòu)建

RNA提取→cDNA反轉(zhuǎn)錄合成→PCR擴(kuò)增→連接載體并電轉(zhuǎn)化→細(xì)菌文庫(kù)/噬菌體文庫(kù)建立

3.3 抗體庫(kù)篩選

常規(guī)使用的篩選方法是固相篩選，磁珠和細(xì)胞篩選，卡梅德生物可以根據(jù)客戶需求提供定制化的篩選體系。

3.4 抗體表達(dá)與功能驗(yàn)證

構(gòu)建哺乳表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)→過鎳柱純化→親和力測(cè)定

圖2：Fc-VHH納米抗體表達(dá)結(jié)果圖片

4. 雙特異性納米抗體的制備

雙特異性抗體制備的方法目前主要有化學(xué)偶聯(lián)法、雙雜交瘤融合法、重組基因法。
（1）化學(xué)偶聯(lián)法：原理是通過化學(xué)偶聯(lián)劑（如鄰苯二馬來酰亞胺、N-琥珀酰-3-（2-吡啶二硫基）丙酸鹽、二硫代�；�苯甲酸等）將兩個(gè)完整IgG或兩個(gè)F(ab)2抗體片段偶聯(lián)成一種BsAb，優(yōu)點(diǎn)是方法操作簡(jiǎn)單，速度快，缺點(diǎn)是容易致癌。
（2）雙雜交瘤融合法：利用細(xì)胞融合技術(shù)制備雜交瘤細(xì)胞系，然后對(duì)特定的抗體進(jìn)行分離。雜交瘤細(xì)胞系制備會(huì)讓重鏈-輕鏈抗體隨機(jī)結(jié)合，因此制備的雙特異性抗體具有隨機(jī)性，效率比較低。
（3）重組基因法：這種方法可以解決雙雜交瘤融合法重鏈-輕鏈抗體隨機(jī)結(jié)合的問題，是目前最普遍使用的方法。

5. 雙特異性納米抗體構(gòu)建

 由于納米抗體只有一個(gè)重鏈可變區(qū)，雙特異性納米抗體的設(shè)計(jì)避免了雙抗體制備過程中重鏈與輕鏈的錯(cuò)配，從而實(shí)現(xiàn)了通用設(shè)計(jì)，開發(fā)了多種設(shè)計(jì)雙特異性抗體的方法。
（1）VHH可組裝成雙特異性抗體，用于提高抗原結(jié)合的特異性，減少脫靶效應(yīng)，用于同一抗原的不同表位，雙特異性抗體可與不同抗原的納米抗體組合在一起。
（2）為了制備多特異性納米抗體，雙特異性納米抗體可與其它多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合。
（3）FC片段也可用于將VHH與SCFV片段偶聯(lián)產(chǎn)生雙抗，可以增強(qiáng)ADCC或ADCP效應(yīng)。雙特異性納米抗體可以作為CAR-T療法中的工具。CAR-T療法是一種新型的精準(zhǔn)靶向治療腫瘤的療法，即嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法。利用基因工程技術(shù)，將激活的T細(xì)胞安裝在定位導(dǎo)航裝置CAR(腫瘤嵌合抗原受體)上，將T細(xì)胞打造成“超級(jí)戰(zhàn)士”CAR，能準(zhǔn)確、專門地識(shí)別和消除體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。 

圖3：納米抗體改造

6. 雙特異性藥物發(fā)展現(xiàn)狀

目前已有3款雙特異性抗體藥物成功上市，先后順序是Catumaxomab（卡妥索單抗）2009年上市，用于惡性腹腔積液的治療；Blinatumomab（博納吐單抗）2014年上市，用于急性淋巴細(xì)胞白血病的治療；Emicizumab2017年上市，用于A型血友病的治療。雙特異性抗體藥物極具市場(chǎng)前景，目前諸多跨國(guó)藥企如羅氏、輝瑞等紛紛推出相關(guān)抗體藥物，相信不久的未來，科技不斷發(fā)展會(huì)研發(fā)出更多抗體藥物，為患者帶去希望。