表觀遺傳學(xué)與腦卒中：DNA甲基化的作用及衰老對(duì)血腦屏障修復(fù)的影響

腦卒中（俗稱中風(fēng)）是導(dǎo)致死亡和長(zhǎng)期殘疾的主要原因，尤其是對(duì)于老齡人來說。腦卒中的平均生存時(shí)間為6-7年，許多患者存在身體殘疾和晚期認(rèn)知功能障礙。腦卒中后的神經(jīng)功能預(yù)后取決于許多因素，包括年齡、梗死面積和部位、遺傳因素以及腦修復(fù)程度。腦卒中后的腦修復(fù)包括重建血腦屏障（blood–brain barrier，BBB）結(jié)構(gòu)和功能等。鑒定和表征導(dǎo)致BBB修復(fù)不完全的因素和過程是成功修復(fù)BBB和改善腦卒中后修復(fù)的關(guān)鍵。

近年來，表觀遺傳學(xué)作為組織修復(fù)的高階調(diào)控機(jī)制，在腦卒中發(fā)病機(jī)制和腦卒中后修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。表觀遺傳學(xué)指不依賴于DNA序列主要變化的基因表達(dá)改變，它依賴于環(huán)境因素和基因組之間的互作。三種表觀遺傳因素對(duì)生物體功能至關(guān)重要：DNA甲基化、翻譯后組蛋白修飾（例如乙�；�、甲基化、磷酸化和泛素化）和非編碼RNA。DNA甲基化模式變化是包括腦血管疾病在內(nèi)的多種疾病的標(biāo)志。DNA甲基化在腦卒中和調(diào)節(jié)腦卒中后BBB修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。然而，DNA甲基化與腦卒中后BBB功能和結(jié)構(gòu)完整性之間的相關(guān)性仍不清楚。
 
2023年02月28日，美國(guó)密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院Anuska V. Andjelkovic團(tuán)隊(duì)在《Fluids Barriers CNS》雜志發(fā)表題為“Epigenetics and stroke: role of DNA methylation and effect of aging on blood–brain barrier recovery”的研究文章，該研究通過簡(jiǎn)化基因組甲基化測(cè)序（RRBS）及對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）分析了幼齡（young）和老齡（old）小鼠腦卒中后BBB修復(fù)的甲基化和轉(zhuǎn)錄組圖譜，強(qiáng)調(diào)了可能影響B(tài)BB修復(fù)的年齡相關(guān)過程和因素。

標(biāo)題：Epigenetics and stroke: role of DNA methylation and effect of aging on blood–brain barrier recovery（在血腦屏障修復(fù)中的DNA甲基化作用和衰老影響）
時(shí)間：2023-02-28
期刊：Fluids and Barriers of the CNS
影響因子：IF 6.961
技術(shù)平臺(tái)：RRBS、RNA-seq等

研究摘要：
血腦屏障（BBB）功能的不完全修復(fù)是腦卒中預(yù)后的主要影響因素。腦卒中后BBB如何修復(fù)仍然未知。新的證據(jù)表明，表觀遺傳因素在調(diào)節(jié)腦卒中后血腦屏障（BBB）修復(fù)中起著重要作用。本研究旨在評(píng)估血栓栓塞性（thromboembolic，TE）腦卒中后腦微血管的表觀遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄組表征，以鑒定限制BBB修復(fù)的潛在原因。研究結(jié)果表明，與年齡匹配的對(duì)照組相比，對(duì)從幼齡（6月齡，young組）和老齡（18月齡，old組）小鼠腦卒中后7天分離的微血管進(jìn)行RNA測(cè)序（RNA-seq）和簡(jiǎn)化基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序（RRBS）分析。比對(duì)至注釋基因，腦卒中后微血管的DNA甲基化分析鑒定出老齡小鼠中的11287個(gè)差異甲基化區(qū)域（DMR）和幼齡小鼠中的9818個(gè)DMR。這些DMR在編碼細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白（如細(xì)胞連接和細(xì)胞極性、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、細(xì)胞外基質(zhì)）、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和通路（如鉀跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、有機(jī)陰離子和無機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）、參與內(nèi)皮細(xì)胞過程的蛋白質(zhì)（如血管生成/血管生成、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控）基因中富集。甲基化和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的整合分析鑒定出細(xì)胞連接（occludin）、肌動(dòng)蛋白重塑（ezrin）以及Rho GTPase（RhoA和Cdc42ep4）等信號(hào)通路變化。衰老作為異常甲基化的樞紐，通過結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)（如claudin-5）的深度變化（高甲基化和抑制）以及參與內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因（如Sox9、Snai1）的激活、抗血管生成和表觀遺傳調(diào)控，影響B(tài)BB修復(fù)過程。這些結(jié)果表明，DNA甲基化通過調(diào)節(jié)與BBB修復(fù)相關(guān)的過程在腦卒中后BBB修復(fù)中起重要作用，并普遍與增強(qiáng)BBB損傷過程有關(guān)。
 
項(xiàng)目設(shè)計(jì)：
幼齡C57BL/6雄性小鼠（6月齡）和老齡C57BL/6雄性小鼠（18-20月齡），將血栓栓塞混懸液（8 mg/100μl）注入小鼠頸內(nèi)動(dòng)脈。從腦微血管中分離基因組DNA和RNA，進(jìn)行RRBS和RNA-seq測(cè)序分析。
圖1：實(shí)驗(yàn)流程圖
幼齡和老齡小鼠經(jīng)血栓栓塞（TE）腦卒中處理。在安樂死和微血管分離之前，分別在第1天和第7天進(jìn)行T2 MRI和T1 MRI以確定梗塞面積和BBB通透性（流入速率常數(shù)Ki）。微血管檢測(cè)甲基化和轉(zhuǎn)錄組變化。圖表表示平均值 ±SD，n=5，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。


實(shí)驗(yàn)結(jié)果
（1）腦卒中后BBB修復(fù)的DNA甲基化譜
圖2：TE腦卒中后血腦屏障修復(fù)的DNA甲基化分析

1. 在6月齡的小鼠中，全基因組DNA甲基化檢測(cè)顯示在TE腦卒中后整體甲基化降低趨勢(shì)。數(shù)據(jù)表示5mC平均百分比±SEM，n=2
2. 差異甲基化區(qū)域（DMR）火山圖，x軸和y軸分別顯示甲基化差異百分比和-log10（q值）。顯著DMR（甲基化差異>25%和q值<0.01）紅色顯示，無統(tǒng)計(jì)顯著性DMR以黑色顯示。
3. 條形圖總結(jié)了每個(gè)基因組區(qū)域（左）和CpG區(qū)域（右）的顯著DMR百分比。高甲基化DMR百分比為紅色，低甲基化DMR百分比為藍(lán)色。

D-E.  結(jié)構(gòu)（D）和信號(hào)（E）GO分析的基因過表達(dá)數(shù)據(jù)匯總，x軸顯示基因數(shù)。
圖3：幼齡小鼠（6月齡）腦卒中后BBB修復(fù)中DMR的基因組位點(diǎn)。
A-B.   基因啟動(dòng)子區(qū)（A）和非啟動(dòng)子區(qū)域（B）的DMR火山圖
C-G.   細(xì)胞連接、極性和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架（C）、血管生成和內(nèi)皮基因（D）、信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子（E）、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和通道（F）、細(xì)胞粘附和細(xì)胞外基質(zhì)（G）相關(guān)基因的差異甲基化。所有DMR，無論統(tǒng)計(jì)顯著性如何，均表示為與內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)的基因，含有顯著DMR的基因用星號(hào)（*）表示�；�因啟動(dòng)子DMR為紅色，基因體DMR為藍(lán)色。位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1-5 kb或無基因組位置的其他DMR為灰色

（2）甲基化組變化對(duì)腦卒中后血腦屏障（BBB）修復(fù)轉(zhuǎn)錄組譜的影響
圖4：6月齡小鼠腦卒中后BBB DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組圖譜比較分析

1. 差異表達(dá)基因（DEG）火山圖。X軸表示log2倍變化，y軸表示−log10（調(diào)整后的p值）。顯著性DEG（log2FC的絕對(duì)值 > 0.58和調(diào)整后的p值 < 0.05）為紅色，無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異的DEG為黑色。
2. 上調(diào)DEG（上）和下調(diào)DEG（下）基因過表達(dá)分析。
3. 具有差異甲基化啟動(dòng)子（左）或非啟動(dòng)子區(qū)域（右）的DEG數(shù)量Venn圖。僅統(tǒng)計(jì)顯著DEG和DMR。如果一個(gè)基因包含多個(gè)DMR，則該基因僅計(jì)一次。
4. 基因表達(dá)和甲基化發(fā)生顯著變化的基因，基因表達(dá)變化與啟動(dòng)子甲基化（左）或非啟動(dòng)子甲基化（右）之間的Pearson相關(guān)性，log2FC位于x軸，甲基化變化位于y軸。啟動(dòng)子區(qū)域甲基化（R=−0.045，p=0.67）和非啟動(dòng)子區(qū)甲基化（R=−0.019，p=0.52）均與基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。標(biāo)記基因與內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)

 
（3）衰老對(duì)腦卒中后修復(fù)血腦屏障（BBB）DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組譜的影響
圖5：衰老對(duì)腦卒中后BBB恢復(fù)過程中DNA甲基化譜的影響

1. 全基因組DNA甲基化檢測(cè)表明，老齡小鼠（18月齡）TE腦卒中后分離微血管（BBB）的整體甲基化水平?jīng)]有變化。數(shù)據(jù)表示5mC含量的平均百分比±SEM，n=2
2. 老齡TE腦卒中小鼠的DMR火山圖，x軸甲基化百分比差異和y軸−log10（q值）。顯著DMR以紅色突出顯示（甲基化差異>25%和q值<0.01），不顯著DMR顯示為黑色。
3. 每個(gè)基因組區(qū)域和CpG區(qū)域顯著DMR百分比條形圖。高甲基化DMR用紅色表示，低甲基化DMR用藍(lán)色表示。

D-E. 結(jié)構(gòu)（D）和信號(hào)（E）的基因過表達(dá)GO富集分析。
 
圖6：老齡小鼠（18月齡）腦卒中后BBB修復(fù)中DMR的基因組位點(diǎn)


圖7：老齡小鼠（18月齡）腦卒中后血腦屏障DNA甲基化組圖譜比較分析


（4）幼齡和老齡小鼠腦卒中后BBB恢復(fù)的共有和特異性轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化組圖譜
圖8：幼齡和老齡小鼠腦卒中后BBB中DNA甲基化變化的共有和特異性DEG


結(jié)論：
腦卒中后血腦屏障（BBB）修復(fù)過程中存在DNA甲基化變化，可以調(diào)節(jié)修復(fù)BBB特性的過程，同時(shí)激活和調(diào)節(jié)一些導(dǎo)致BBB損傷的因素。本研究通過RRBS、RNA-seq等組學(xué)分析研究了不同齡小鼠腦卒中后恢復(fù)中的全基因組DNA甲基化模式，定義了BBB恢復(fù)的持續(xù)過程（即血管生成、屏障維持、通過Rho-GTPase和Wnt/β-catenin蛋白信號(hào)以及EndMT進(jìn)行的信號(hào)調(diào)控）及其可能限制恢復(fù)過程的表觀遺傳學(xué)（甲基化）變化，導(dǎo)致嚴(yán)重的BBB損傷。本研究為腦卒中后血腦屏障和腦血管功能下降的病因提供了新的見解，并為藥物發(fā)現(xiàn)和靶向治療開辟了新的途徑。


參考文獻(xiàn)：
Phillips CM, Stamatovic SM, Keep RF, Andjelkovic AV. Epigenetics and stroke: role of DNA methylation and effect of aging on blood-brain barrier recovery. Fluids Barriers CNS. 2023 Feb 28;20(1):14.