WGBS等揭示SOX30甲基化在非梗阻性無精癥中的表觀遺傳調(diào)控機制
不孕不育是生殖健康中非常嚴重的問題之一。約一半不孕不育由男性因素引起，其中約15%為精液中完全沒有精子的無精癥。無精癥分為梗阻性無精癥（obstructive azoospermia，OA，約占40%）和非梗阻性無精癥（non-obstructive azoospermia，NOA，約占60%）。OA伴睪丸生精功能正常是由于排液管物理梗阻而不能產(chǎn)生成熟精子的結(jié)果； NOA是人類男性不育最嚴重的形式，是睪丸生精異常而無法產(chǎn)生睪丸精子的結(jié)果。截至目前超過80%的NOA病因不明。
越來越多的證據(jù)表明，生殖細胞中正常的甲基化模式與男性生育力高度相關(guān)。表觀遺傳學(xué)變化是否與NOA疾病相關(guān)尚不清楚。
2020年03月06日，陸軍醫(yī)科大學(xué)（第三軍醫(yī)大學(xué)）預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)研究所韓飛教授等為第一作者，曹佳教授、劉晉祎教授為通訊作者以"Epigenetic Inactivation of SOX30 Is Associated with Male Infertility and Offers a Therapy Target for Non-obstructive Azoospermia"為題在《Mol Ther Nucleic Acids》雜志發(fā)表研究論文。該研究通過對OA和NOA患者之間的睪丸活檢標本中的DNA甲基化進行全基因組比較分析，鑒定出SOX30為不孕不育的關(guān)鍵男性特異性因子，為人類NOA疾病的治療提供了前瞻性靶點。
標題：Epigenetic Inactivation of SOX30 Is Associated with Male Infertility and Offers a Therapy Target for Non-obstructive Azoospermia（SOX30的表觀遺傳失活與男性不育有關(guān)，并為非梗阻性無精癥提供了治療靶點）
發(fā)表期刊：Molecular Therapy-Nucleic Acids
發(fā)表日期：2020年03月06日
影響因子：IF 8.8
技術(shù)：全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）等
樣品：
睪丸活檢標本取自O(shè)A和NOA患者（排除既往有睪丸損傷的患者）
OA對照組：從326名OA患者中選擇15名年齡在20-42歲的OA男性作為對照組織
NOA測試組：從176名NOA患者中選擇58名年齡在20-45歲的NOA男性，包括31例無精子（spermatozoa）NOA患者（NOA-I）、22例無精細胞（spermatid）患者（NOA-II）和5例無精母細胞（spermatocyte）NOA患者（NOA-III），提取DNA進行DNA甲基化分析
摘要
非梗阻性無精癥（NOA）是最嚴重的男性不育形式，然而NOA病因尚不清楚，導(dǎo)致缺乏臨床治療。本研究對NOA患者的DNA甲基化進行了全基因組比較分析，并將SOX30鑒定為NOA患者睪丸組織中啟動子區(qū)域最顯著的高甲基化基因。SOX30啟動子高甲基化直接導(dǎo)致其在NOA中表達沉默，SOX30表達水平下調(diào)與NOA疾病嚴重程度相關(guān)。小鼠中Sox30缺失特異性的影響睪丸發(fā)育和精子發(fā)生，導(dǎo)致睪丸中完全沒有精子，從而導(dǎo)致男性不育，但不影響卵巢發(fā)育和女性生育力。Sox30缺失小鼠模型的病理學(xué)和睪丸大小與NOA患者高度相似，成年期Sox30缺失小鼠中Sox30重新表達可逆轉(zhuǎn)睪丸病理損傷并恢復(fù)精子發(fā)生。在Sox30缺失小鼠中重新表達Sox30后，重新發(fā)生的精子具有開始妊娠的能力。此外，Sox30重新表達的Sox30缺失小鼠的雄性后代仍能生育，這些雄性后代及其子代可以正常生活1年以上，且體貌與野生型小鼠相比無顯著差異。綜上所述，SOX30甲基化失活會特異性影響精子發(fā)生，可能導(dǎo)致NOA疾病，而SOX30重新表達可以成功恢復(fù)精子發(fā)生和實際生育力。本研究進一步加深了對NOA發(fā)病機制的理解，為NOA疾病的治療提供了一個有希望的靶點。
研究結(jié)果：
（1）SOX30在NOA患者的睪丸組織中高甲基化
圖1：SOX30被鑒定為NOA睪丸組織中的高甲基化基因
表1：OA和NOA患者睪丸組織中的3號染色體、18號染色體和5號染色體啟動子區(qū)DMR的高甲基化基因
（2）SOX30啟動子高甲基化沉默與NOA高度相關(guān)
（3）Sox30基因缺失會特異性的影響睪丸發(fā)育和精子發(fā)生，導(dǎo)致不育
（4）Sox30-/-小鼠模型的病理學(xué)和睪丸大小與NOA患者相似
（5）Sox30缺失導(dǎo)致的不孕癥可通過Sox30重新表達來恢復(fù)生育力
易基因小結(jié)：
本研究通過對OA和NOA患者睪丸活檢標本的全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）分析，揭示了SOX30的甲基化失活會特異性地影響睪丸發(fā)育和精子發(fā)生，可能導(dǎo)致NOA疾病，SOX30重新表達可以成功恢復(fù)精子發(fā)生和實際生育能力。本研究為人類NOA疾病提供了重要的治療靶點。
參考文獻：
Han F, Jiang X, Li ZM, Zhuang X, Zhang X, Ouyang WM, Liu WB, Mao CY, Chen Q, Huang CS, Gao F, Cui ZH, Ao L, Li YF, Cao J, Liu JY. Epigenetic Inactivation of SOX30 Is Associated with Male Infertility and Offers a Therapy Target for Non-obstructive Azoospermia. Mol Ther Nucleic Acids. 2020 Mar 6;19:72-83.
越來越多的證據(jù)表明，生殖細胞中正常的甲基化模式與男性生育力高度相關(guān)。表觀遺傳學(xué)變化是否與NOA疾病相關(guān)尚不清楚。
2020年03月06日，陸軍醫(yī)科大學(xué)（第三軍醫(yī)大學(xué)）預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)研究所韓飛教授等為第一作者，曹佳教授、劉晉祎教授為通訊作者以"Epigenetic Inactivation of SOX30 Is Associated with Male Infertility and Offers a Therapy Target for Non-obstructive Azoospermia"為題在《Mol Ther Nucleic Acids》雜志發(fā)表研究論文。該研究通過對OA和NOA患者之間的睪丸活檢標本中的DNA甲基化進行全基因組比較分析，鑒定出SOX30為不孕不育的關(guān)鍵男性特異性因子，為人類NOA疾病的治療提供了前瞻性靶點。
標題：Epigenetic Inactivation of SOX30 Is Associated with Male Infertility and Offers a Therapy Target for Non-obstructive Azoospermia（SOX30的表觀遺傳失活與男性不育有關(guān)，并為非梗阻性無精癥提供了治療靶點）
發(fā)表期刊：Molecular Therapy-Nucleic Acids
發(fā)表日期：2020年03月06日
影響因子：IF 8.8
技術(shù)：全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）等
樣品：
睪丸活檢標本取自O(shè)A和NOA患者（排除既往有睪丸損傷的患者）
OA對照組：從326名OA患者中選擇15名年齡在20-42歲的OA男性作為對照組織
NOA測試組：從176名NOA患者中選擇58名年齡在20-45歲的NOA男性，包括31例無精子（spermatozoa）NOA患者（NOA-I）、22例無精細胞（spermatid）患者（NOA-II）和5例無精母細胞（spermatocyte）NOA患者（NOA-III），提取DNA進行DNA甲基化分析
摘要
非梗阻性無精癥（NOA）是最嚴重的男性不育形式，然而NOA病因尚不清楚，導(dǎo)致缺乏臨床治療。本研究對NOA患者的DNA甲基化進行了全基因組比較分析，并將SOX30鑒定為NOA患者睪丸組織中啟動子區(qū)域最顯著的高甲基化基因。SOX30啟動子高甲基化直接導(dǎo)致其在NOA中表達沉默，SOX30表達水平下調(diào)與NOA疾病嚴重程度相關(guān)。小鼠中Sox30缺失特異性的影響睪丸發(fā)育和精子發(fā)生，導(dǎo)致睪丸中完全沒有精子，從而導(dǎo)致男性不育，但不影響卵巢發(fā)育和女性生育力。Sox30缺失小鼠模型的病理學(xué)和睪丸大小與NOA患者高度相似，成年期Sox30缺失小鼠中Sox30重新表達可逆轉(zhuǎn)睪丸病理損傷并恢復(fù)精子發(fā)生。在Sox30缺失小鼠中重新表達Sox30后，重新發(fā)生的精子具有開始妊娠的能力。此外，Sox30重新表達的Sox30缺失小鼠的雄性后代仍能生育，這些雄性后代及其子代可以正常生活1年以上，且體貌與野生型小鼠相比無顯著差異。綜上所述，SOX30甲基化失活會特異性影響精子發(fā)生，可能導(dǎo)致NOA疾病，而SOX30重新表達可以成功恢復(fù)精子發(fā)生和實際生育力。本研究進一步加深了對NOA發(fā)病機制的理解，為NOA疾病的治療提供了一個有希望的靶點。
圖形摘要：SOX30與人類NOA疾病發(fā)展示意圖
在出生后睪丸中，當啟動子未甲基化時，SOX30高表達，精子發(fā)生正常。當啟動子高甲基化時，SOX30表達沉默，精子發(fā)生受限，NOA疾病發(fā)展。
在出生后睪丸中，當啟動子未甲基化時，SOX30高表達，精子發(fā)生正常。當啟動子高甲基化時，SOX30表達沉默，精子發(fā)生受限，NOA疾病發(fā)展。
研究結(jié)果：
（1）SOX30在NOA患者的睪丸組織中高甲基化
圖1：SOX30被鑒定為NOA睪丸組織中的高甲基化基因
- 與OA睪丸組織相比，NOA睪丸組織中不同基因區(qū)域的DNA甲基化水平。箭頭表示NOA中的高甲基化區(qū)域。
- 通過全基因組DNA甲基化分析，將SOX30鑒定為NOA樣品中5號染色體（Chr5）上的優(yōu)先甲基化基因。Circos圖顯示OA和NOA樣品中的Chr5甲基化模式。染色體區(qū)、GC水平，重復(fù)序列水平、基因序列水平、OA樣本甲基化水平和NOA樣本甲基化水平在Circos圖中由外到內(nèi)依次顯示。箭頭表示NOA樣品中SOX30基因的優(yōu)先甲基化位點。橙色框代表SOX30啟動子。與SOX30表達負相關(guān)的高甲基化CpG位點用紅色箭頭表示。
- NOA和OA患者的其他獨立睪丸組織樣本中SOX30差異甲基化位點的分層聚類。關(guān)鍵顏色條表示甲基化水平。NOA-S1、NOA-S2、NOA-S3、OA-S1、OA-S2和OA-S3分別代表NOA-Sample1、NOA-Sample2、NOA-Sample3、OA-Sample1、OA-Sample2和OA-Sample3。
（2）SOX30啟動子高甲基化沉默與NOA高度相關(guān)
圖2：通過高甲基化沉默的SOX30與NOA密切相關(guān)
- 三例OA（OA-S1，-S2，-S3）患者和三例NOA（NOA-S1，-S2，-S3）患者睪丸組織中差異表達基因（≥2倍）的分層聚類分析，以及SOX30作為NOA患者優(yōu)先沉默基因的鑒定。顏色條表示mRNA表達水平。
- 在OA和NOA患者的睪丸活檢標本中進行SOX30的IHC染色。NOA-I、NOA-II和NOA-III分別代表無精子的NOA患者，無精細胞的NOA患者和無精母細胞的NOA患者。箭頭代表精子、精子細胞和精母細胞。標尺代表20μm。
- 在OA和NOA患者的睪丸活檢標本中定量檢測SOX30的IHC染色，****p＜0.0001。
（3）Sox30基因缺失會特異性的影響睪丸發(fā)育和精子發(fā)生，導(dǎo)致不育
圖3：Sox30是男性生育和睪丸發(fā)育所必需的基因
- 分析不同Sox30基因型小鼠的生育力。+/+代表野生型小鼠（Sox30），-/+代表雜合小鼠（Sox30+/+-/+），-/-代表純合小鼠（Sox30-/-）。
- qRT-PCR和WB分析Sox30在具有指定基因型小鼠睪丸中的表達**p＜0.01。β-肌動蛋白用作內(nèi)部對照。
- 在Sox30、Sox30+/+-/+和Sox30-/-小鼠中分別分析睪丸的形態(tài)和重量（Sox30:n=15，Sox30+/+-/+：n=19，Sox30-/-:n=14）**p＜0.01。
- 比較Sox30-/-小鼠在不同發(fā)育階段（出生后40天、120天和180天[dpp]）的睪丸重量**p＜0.01。
- 從5個月以上的Sox30（n=10）、Sox30+/+-/+（n=10）和Sox30-/-（n=10）小鼠中顯示附睪和睪丸切片的H＆E染色。附睪中的箭頭表示精子。睪丸中的箭頭表示精子和精細胞。
（4）Sox30-/-小鼠模型的病理學(xué)和睪丸大小與NOA患者相似
圖4：Sox30-/-小鼠模型的病理學(xué)和睪丸大小與NOA患者相似
- 比較人NOA患者和Sox30-/-小鼠在6個月（n=10）和8個月（n=8）發(fā)育時期睪丸的H＆E染色。在6個月大的Sox30缺失小鼠中，幾乎僅觀察到精母細胞樣細胞、精原細胞和支持細胞。在8個月大的Sox30缺失小鼠中觀察到一些精母細胞樣細胞，幾乎只有精原細胞和支持細胞。
- 比較不同年齡NOA患者的睪丸體積。NOA-II+III（≤30）表示≤30歲的NOA-II和NOA-III患者，NOA-II+III（>30）代表＞30歲的NOA-II和NOA-III患者。
- 比較OA和NOA患者的睪丸體積****p＜0.0001。
（5）Sox30缺失導(dǎo)致的不孕癥可通過Sox30重新表達來恢復(fù)生育力
圖5：Sox30-/-小鼠的不育可以通過Sox30的重新表達來恢復(fù)
- Sox30、Sox30+/+-/-和Sox30重新表達的Sox30-/-（Sox30loxp/loxp）小鼠的睪丸和附睪的H＆E染色。
- 在Sox30-/-小鼠中重新表達Sox30后，通過生育力分析評估重新發(fā)生的精子的生育力。
- 在Sox30（n=5）、Sox30+/+-/-（n=8）和Sox30loxp/loxp（n=14）小鼠中分析睪丸的重量。
圖6：不同基因型小鼠睪丸的病理形態(tài)
- Sox30\Sox30+/+-/-和Sox30重新表達的Sox30-/-（Sox30loxp/loxp）小鼠的睪丸和附睪的H＆E染色。
- B-C. Sox30、Sox30+/+-/-和Sox30loxp/loxp小鼠睪丸中Sox30表達的qRT-PCR（B）和WB（C）分析***p＜0.001。β-肌動蛋白用作內(nèi)部對照。
易基因小結(jié)：
本研究通過對OA和NOA患者睪丸活檢標本的全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）分析，揭示了SOX30的甲基化失活會特異性地影響睪丸發(fā)育和精子發(fā)生，可能導(dǎo)致NOA疾病，SOX30重新表達可以成功恢復(fù)精子發(fā)生和實際生育能力。本研究為人類NOA疾病提供了重要的治療靶點。
參考文獻：
Han F, Jiang X, Li ZM, Zhuang X, Zhang X, Ouyang WM, Liu WB, Mao CY, Chen Q, Huang CS, Gao F, Cui ZH, Ao L, Li YF, Cao J, Liu JY. Epigenetic Inactivation of SOX30 Is Associated with Male Infertility and Offers a Therapy Target for Non-obstructive Azoospermia. Mol Ther Nucleic Acids. 2020 Mar 6;19:72-83.
標簽：
WGBS
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